(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910489605.4
(22)申请日 2013.05.09
(30)优先权数据
61/644,442 2012.05.09 US
(62)分案原申请数据
201380024370.2 2013.05.09
(71)申请人 香港科技大学
地址 中国香港九龙清水湾
申请人 香港浸会大学 澳门科技大学
(72)发明人 梁纯 姜志宏 王紫壹 禹志领
王静蓉 白丽萍
(74)专利代理机构 天津市北洋有限责任专利代
理事务所 12201
北京世界园艺博览会中国馆代理人 曹玉平
(51)Int.Cl.G01N 33/68(2006.01)G01N 33/574(2006.01)G01N 33/533(2006.01)G01N 33/50(2006.01)A61P 35/00(2006.01)A61K 31/7048(2006.01)
(54)发明名称
癌症上的应用
(57)摘要
本发明描述了通过抑制人类MCM蛋白复合物
来癌症的方法和化合物，这些化合物抑制
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MCM蛋白由6个亚基形成环状结构的复合物，
从而失去在DNA的复制过程中的功能。另外也建立出
一个药物筛选机制，通过检测MCM蛋白亚基的亚
的药物。权利要求书1页 说明书10页 附图12页CN 110412285 A 2019.11.05
C N 110412285
A
1.一种筛选抗癌药物的方法，该方法能够筛选出对癌细胞有杀伤力而不影响正常细胞的药物，其特征在于，该方法通过验证候选药物能否破坏MCM蛋白复合物的形成，使MCM的亚基被留在细胞质中而不会被运往细胞核而失去功能的步骤实现。 2.如权利要求1所述的方法，其步骤如下：
1)将候选化合物加到细胞培养液中，处理细胞一定的时间；
2)检测上述细胞中有功能的MCM蛋白复合物的水平，来实现对具有抗癌作用的化合物的筛选。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述检测有功能的MCM蛋白复合物的水平通过检测MCM亚基在细胞核和细胞质当中分布的比例来实现。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述检测MCM亚基在细胞中的分布通过间接荧光检测的方法来实现，细胞经化合物处理后，带有荧光标记的二抗能够识别结合了内源MCM蛋白一抗，从而确定MCM蛋白复合物在细胞中位置。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述检测MCM亚基在细胞中的分布通过直接荧光的检测方法来实现，具体通过在细胞中转染能够表达一个或多个融合了荧光蛋白的MCM亚基的质粒，在化合物处理细胞后，融合了荧光蛋白的MCM亚基就能够被检测到。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述检测有功能的MCM蛋白复合物的水平通过检测MCM亚基之间相互作用或MCM蛋白和染体的结合量来实现。
7.一种能够抑制癌细胞中MCM蛋白复合物的化合物在制备和/或缓解宫颈腺癌、鼻咽癌和/或肝癌的药物中的用途，其中所述化合物选自17-β-去乙酰海芒果素，17-β-去乙酰海芒果素二醇，17-β-黄花
夹竹桃次甙中的任一种，所述化合物能够有效抑制肿瘤细胞的增殖并且有效地杀死肿瘤细胞，但对正常细胞的杀伤力很小。
8.如权利要求7所述的用途，其中所述化合物能够干扰MCM亚基组装成MCM蛋白复合物。
9.如权利要求7所述的用途，其中所述化合物通过干扰MCM蛋白复合物中hMcm2和hMcm6的相互作用而破坏MCM蛋白复合物的形成和结构。
10.如权利要求7所述的用途，其中所述MCM蛋白复合物是具有完整功能的杂六元环蛋白复合体，并能够进入细胞核中参与DNA的复制。
权 利 要 求 书1/1页CN 110412285 A
抑制MCM蛋白复合物的方法和化合物及其在癌症上的
应用
相关申请的交叉引用
[0001]本专利申请与提交于2013年5月9日之国际专利合作条约专利申请(PATENT COOPERATION TR
EATY；序号为PCT/US2013/040287)以及提交于2012年5月9日之美国临时专利申请(序号为61/644，442)相关，其阐述的全部内容在这里作为参照引用。
发明领域：彭州葛仙山风景区
[0002]该发明的内容是有关用药物来抑制含有6个亚基的杂环状MCM蛋白复合体在癌细胞DNA复制过程中的功能来癌症，而且有关如何通过检测在候选药物处理过的细胞中MCM蛋白亚基如hMcm2and hMcm6的位置及其功能，筛选和鉴定出该类化合物。
发明背景
[0003]癌细胞会失控般生长、分裂、侵蚀周围组织，并通过淋巴和血液循环系统可以侵入或扩散到身体其他部分。常规的癌症包括切除或摧毁癌细胞组织，例如，手术、化疗、放疗、免疫疗法等。然后，所有疗法面临的共同挑战是如何在切底摧毁癌细胞的同时对正常细胞和组织不造成严重的损害。近几十年来，化疗领域就一直关注于具有细胞毒的化合物的研发与投入。大量的化合物被证明具有细胞毒及抗肿瘤功效。超过600000种的细胞毒化合物中只有大约40种被认为具有一定的临床意义(Schwartsmann et al.,by 1988)。这种较低成功筛选率的原因在于药物的毒性导致它们往往在有效抗癌剂量和毒性剂量之间有着非常窄的窗。这样以具有细胞毒的化合物为基础的抗肿瘤药物的筛选受到了很大程度的限制，并且距离真正具有临床疗效还有较大的差距。所以现在我们需要的是对癌细
胞有更强大的特异性，也就是在抗肿瘤的同时不会对正常的细胞核组织造成巨大损害的药物。
发明概述：
[0004]本发明的目标即为：提供一种能够摧毁肿瘤细胞而对正常细胞和组织不会造成重大损害的方法和药物。该方法是通过破坏MCM(minichromosome maintenance；微染体维持蛋白)复合物的形成，该蛋白在复制前复合物(pre-replicative complex；pre-RC)的组装(此过程也称为复制许可)及DNA复制的延伸过程中起着关键的作用。DNA复制的起始需要一系列的复制起始蛋白，以在每个复制原点上有序地形成复制前复合物。MCM复合物的活性需要所有的六个MCM亚基(MCM2-MCM7)，以形成一个杂六元环，并在ORC1-6，NOC3，IPI1-3，CDT1，Cdc6和可能其他蛋白质的帮助下，被组装到复制起点上。作为AAA+(ATPases associated with a variety of cellular activities；参与各种细胞活动ATP酶)家族的成员蛋白，MCM复合物沿着复制叉移动，可能作为复制解旋酶，解开DNA双链。由于所有的六个MCM亚基在DNA复制中所需要的，发明人的前期研究公开于US Pat.Nos.7393950和8318922(该专利在此作为参照引用)，研究表明：能够与MCM亚基特异结合的反义寡核苷酸序列可以抑制细胞增殖。
[0005]因为MCM蛋白的所有亚基要形成完整的环状才可以实现其功能，所以在中断杂六聚体复合物的任何两个亚基之间的相互作用应该破坏MCM环结构，并灭活MCM复合物，抑制
DNA复制，并引起肿瘤细胞凋亡而对正常细胞无影响。在本发明中，我们从植物提取物、组分和化合物文库以及人工合成的化合物中筛选并确定了几个可以抑制人类MCM蛋白的相互作用与活性，并阻断肿瘤细胞的DNA复制和细胞增殖的化合物。作为本发明的实施按例，我们鉴定和发明的几个小分子可以破坏hMcm2和hMcm6之间的相互作用，削弱MCM蛋白的核定位及其与染质的结合，并抑制DNA复制。此外，这些化合物可以诱导肿瘤细胞凋亡而对正常细胞没有明显的细胞毒性，并在裸鼠移植瘤模型中表现出强劲的抗肿瘤活性而对裸鼠没有明显的毒副作用。
[0006]这种特异性的根本原因是：正常细胞拥有能把细胞停滞在G1期的检查系统，从而避免细胞发生凋亡；而癌细胞缺乏此检查系统来控制这个过程，所以正常细胞能够识别MCM 蛋白结构是否完整，功能是否完善，只有当MCM在DNA复制过程中功能完善时，才能够进入S 期进行分裂，否则会暂停在G1期，就像机动车辆会因为发现前方桥梁发生断裂而刹车；而癌细胞会像刹车失灵的车辆因无法暂停而继续前行进入S期。
怀化市公共资源交易中心[0007]该专利的另外一个保护内容是：我们建立了一个筛选抗癌药物的筛选平台，该筛选平台能够筛选出对癌细胞有杀伤力而不影响正常细胞的药物。该方法的实现是通过验证候选药物能否破坏MCM蛋白复合物的形成，使MCM的亚基被留在胞质中而不会被运往细胞核而失去功能。
[0008]该方法的步骤如下：1)将候选化合物加到细胞培养液中，处理细胞一定的时间；2)检测上述细
胞中有功能的MCM蛋白的水平，来实现对具有抗癌作用的化合物的筛选。检测有功能的MCM蛋白的水平可通过检测MCM亚基在细胞核和细胞质当中分布的比例，因为只有功能完整的蛋白复合体才能够存在于细胞核中，这样，化合物对MCM蛋白复合体形成的破坏性越大，能在细胞核中定位的MCM亚基越少。检测MCM亚基在细胞中的分布可用间接荧光检测的方法来实现，细胞经化合物处理后，带有荧光标记的二抗可识别结合了内源MCM蛋白一抗，从而确定MCM蛋白在细胞中位置。另外也可通过方法荧光的直接观测：通过在细胞中转染能够表达一个或多个融合了荧光蛋白的MCM亚基的质粒，例如hMcm2-GFP和/或hMcm6-GFP，这样在化合物处理细胞后，融合了荧光蛋白的MCM亚基就可以被检测到。嘉陵江
[0009]另外，也可通过BrdU核素掺入法、流式细胞仪等方法来检测DNA的复制来实现筛选抗癌药物，同时，也可以通过其他步骤来检测除了破坏MCM结构外，该化合物是否在正常细胞核癌细胞中具有不同的抑制细胞增殖的能力。
[0010]该专利的另一目标是提供通过该机制抗肿瘤的高特异性化合物。具有该功能的化合物一般具有如下结构规律：主结构I(4个环状的主体结构)
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其中R1是H或一到几个糖基；R2是B(β)构型的5或6元环；R3和R4是H或OH；R3和R4也可以是一个O原子并与R3和R4相联的C原子形成一个3元环；R5是OH，R6是H,R5和R6也可以是一个O原子并与R5和R6相联的C原子形成一个3元环。
[0011]目前专利中所保护的所有化合物和相关方法应用于对MCM蛋白的抑制药物敏感的所有癌种，包括宫颈癌、前列腺癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、急性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤、急性淋巴细胞性白血病、胰腺癌、胃癌、皮肤癌、膀胱癌、食道癌、鼻咽癌、小细胞肺癌和非小细胞肺癌等。
[0012]总结：该专利技术核心和保护重点是能够通过破坏MCM蛋白而选择性地摧毁癌细胞的药物。
[0013]作为本专利的一部分，关于此专利的各项创新点在保护内容中做了特别陈述。为了使此专利内容更易于理解，本发明的操作优势、使用目的、参考内容等将在以下图文说明中进一步阐述。
图例
[0014]图1表明：本发明中该抗肿瘤化合物的结构(3-8)和不具有活性的同分异构体(1-2)
[0015]图2中A：直接显微观察；B-H：WST-1(water soluble tetrazolium-1)测量数据；17β-去乙酰海芒果素(17beta-Deacetyltanghinin；见A-C)、17β-黄花夹竹桃次甙(17beta-Neriifolin；见D)和17β-去乙酰基海芒果素二醇(17beta-Deacetyltanghinin diol；见E)是本专利申请中三个具有抗癌活性的化合物代表，这些药物对癌细胞具有较高的选择性，而对正常细胞对性较低。对照药物紫杉醇(Paclitaxel；Taxol；见F)和依托泊苷碳酸盐(VP16；见G和H)对正常细胞的毒性很强，对正常细胞和癌细胞的选择性较差。
[0016]图3表明：通过免疫荧光的方法可以观察到17β-去乙酰海芒果素合17β-黄花夹竹桃次甙可以破坏MCM亚基之间的结合，而17β-去乙酰基海芒果素二醇的作用相对前两者要弱。
[0017]图4表明：通过免疫荧光的方法可以观察到17β-去乙酰海芒果素、17β-黄花夹竹桃次甙和17β-去乙酰基海芒果素二醇都可以破坏hMcm2和hMcm6在细胞核中的定位。[0018]图5表明：染质免疫沉淀实验和流式细胞仪方法表明：17β-去乙酰海芒果素能够抑制复制前复合物(pre-RC)组装，导致癌细胞的凋亡。
[0019]图6表明：流式细胞仪方法可以观察到：17β-去乙酰海芒果素能够抑制DNA的复制，引导癌细胞的凋亡。
[0020]图7表明：通过BrdU核素掺入法可以观察到17β-去乙酰海芒果素能够抑制DNA的复制。
[0021]图8表明：流式细胞仪和膜联蛋白V染的方法可以观察到：17β-去乙酰海芒果素、17-黄花夹竹桃次甙和17-去乙酰基海芒果素二醇都可以导致癌细胞的凋亡。
[0022]图9表明：通过WST-1的方法检测到：用17β-去乙酰海芒果素处理细胞，然后除去该药物，正常细胞可以恢复生长，而癌细胞不能。
[0023]图10表明：在裸鼠中可以观察到17β-去乙酰海芒果素的抗肿瘤作用。
[0024]图11表明：在图10所示的实验中，17β-去乙酰海芒果素对裸鼠无明显毒性。本发明的具体实施方案的详述
细胞系和质粒
[0025]人MCM6和MCM2 cDNA片段分别克隆到pEGFP-C3(Invitrogen公司)以用于细胞内的定位检测。HeLa细胞(宫颈腺癌)、HK1(鼻咽癌)、C666-1(鼻咽癌)、HepG2细胞(肝癌)和Hep3B 细胞(肝癌)，在含有10％的胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中培养。L-02细胞(人正常肝细胞，来源于中国科学院上海生命科学院生物化学及细胞研究所)则培养在10％FBS的RPMI 1640培养基中。NP460细胞培养在附加了S0125(Cascade Biologics公司)的1:1Keratinocyte-SFM(Invitrogen公司)and MEPI 500CA培养基中。所有的细胞系均在37C，5％的二氧化碳的培养箱中培养。
抗增殖活性测定
