第47卷第1期2021年1月吉林大学学报（医学版）
Journal of Jilin University（Medicine Edition）
Vol.47No.1
Jan.2021
DOI：10.13481/j.1671⁃587Ⅹ．20210106
海研站菌S52菌株Cr(Ⅵ)还原酶活性和稳定性及其 还原Cr(Ⅵ)的条件优化
李佳瑶1，李晓夏2，安秋颖1，范春1，郭东北1，唐晨1，张敏1，桑都哈西·歇里亚孜旦1，赵苒1
（1.厦门大学分子疫苗学和分子诊断学国家重点实验室厦门大学公共卫生学院预防医学系，福建厦门361102；2.四川省成都市邛崃市卫生健康局办公室，四川成都611530）
［摘要］目的
目的：研究温度和pH值对海研站菌S52菌株六价铬［Cr（Ⅵ）］还原酶活性和稳定性的影响，优化最佳还原条件，并探讨金属离子和小分子物质对其还原能力的影响。方法 方法：将S52菌株的种子液接种于LB培养基中过夜培养，将菌液离心过滤后得到的胞外活性物质、超声波冰浴破菌得到胞内活性物质和对照组S52全菌液分别加入到含50mg·L－1Cr（Ⅵ）的LB培养基中，在37℃、pH值为8.0条件下培养，于0、3、6、12、24和48h分别用二苯碳酰二肼分光光度法测定各组溶液中的Cr（Ⅵ）浓度，计算不同时刻Cr（Ⅵ）还原率、细胞内外还原酶的相对活性及相对稳定性。设定温度为25℃、30℃、35℃、40℃、45℃和50℃，pH值为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，采用混合实验设计，计算细胞内外还原酶在0、3、6和12h对Cr（Ⅵ）的还原率，分析不同温度和pH值处理组中细胞内外Cr（Ⅵ）还原酶对Cr（Ⅵ）还原率的变化，探讨最佳还原条件。分别将浓度为0.2mmol·L－1的Cu2+、Mn2+和Cd2+溶液，1mmol·L－1的十二烷基磺酸钠（SDS）和乙二胺四乙酸（EDTA），1%的Triton×100和吐温80加入到培养基中作为处理组，以未作处理的培养基为对照组，在最优还原条件下与50mg·L－1Cr（Ⅵ）反应3h，测定并计算Cr（Ⅵ）还原率，比较不同金属离子和小分子物质处理组中细胞内外还原酶对Cr（Ⅵ）的还原率。结果
结果：3h时，胞内酶和胞外酶对Cr（Ⅵ）的还原率达到最高，且胞内酶的还原能力高于胞外酶（P<0.05）。当温度一定时，pH值从5.0到6.0，胞内酶和胞外酶对Cr（Ⅵ）的还原率均明显升高；随着pH值逐渐升高，其还原率大幅降低。当pH值一定时，随温度升高，胞内酶对Cr（Ⅵ）的还原率逐
渐提高，胞外酶对Cr（Ⅵ）的还原率逐渐降低。不同温度、pH值组间Cr（Ⅵ）还原率比较差异有统计学意义（P<0.05），温度与pH值之间具有明显的交互效应（P<0.05）。与对照组比较，Cu2+处理组胞内酶和胞外酶对Cr（Ⅵ）的还原率明显升高（P<
0.05），而Cd2+和Mn2+处理组胞内酶和胞外酶对Cr（Ⅵ）的还原率明显降低（P<0.05）；与对照组
比较，小分子物质TritonX-100处理组胞内酶和胞外酶对Cr（Ⅵ）的还原率差异无统计学意义（P>
0.05），而吐温80、EDTA和SDS处理组胞内酶和胞外酶对Cr（Ⅵ）的还原率明显降低（P<0.05）。
结论
结论：S52菌株的Cr（Ⅵ）还原酶在细胞内和细胞外均可发挥还原作用，且胞内酶的还原作用更强。
胞内酶最适温度为35℃~45℃，最适pH值为7.0；胞外酶最适温度为25℃~30℃，最适pH值为7.0。
不同金属离子和小分子物质对Cr（Ⅵ）还原酶活性有不同的影响。
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［关键词］海研站菌S52菌株；六价铬；还原酶；温度；pH值；金属离子；小分子物质
［中图分类号］R123;X52［文献标志码］Ａ
[文章编号]1671⁃587Ⅹ(2021)01⁃0044⁃09
[收稿日期]2020⁃07⁃21
[基金项目]国家自然科学基金面上项目（81673129）；福建省教育厅中青年教师教育科研项目（JAT160001）；厦门大学2017年大学生创新创业训练计划支持项目（2017X0595）
[作者简介]李佳瑶（1995－），女，山东省平阴县人，在读硕士研究生，主要从事环境健康风险评价与微生物修复技术等方面的研究。
[通信作者]赵苒，副教授，硕士研究生导师（E-mail：***************）
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45李佳瑶，等.海研站菌S52菌株Cr(Ⅵ)还原酶活性和稳定性及其还原Cr(Ⅵ)的条件优化
Activity and stability of reductase of Mesonia sp.S52Cr(Ⅵ)and its optimization of Cr(Ⅵ)reduction conditions LI Jiayao1,LI Xiaoxia2,AN Qiuying1,FAN Chun1,GUO Dongbei1,TANG Chen1,ZHANG Min1,
SANGDUHAX Xieryazdan1,ZHAO Ran1
（1.State Key Laboratory of Molecular Vaccinology and Molecular Diagnostics，Department of Preventive Medicine，School of Public Health，Xiamen University，Xiamen361102，China；2.Office Department，
Qionglai Health Bureau，Chengdu611530，China）
ABSTRACT Objective：To explore the effects of temperature and pH value on the enzyme activity and stability of Mesonia sp.S52Cr（Ⅵ）and optimize the reduction conditions，and to study the effects of metal ions and small molecules on the reducing ability of the reductase.Methods：The seed solution of the S52 strain was inoculated and cultured overnight in LB medium.The extracellular active substance obtained by centrifugal filtration of the bacterial solution，the intracellular active substance obtained by ultrasonic ice-breaking bacteria and the S52whole bacterial solution were added to the LB medium containing50mg·L－1 Cr（Ⅵ）and cultured at37℃，pH8.0.Benzyl dihydrazide spectrophotometry was used to determine the Cr（Ⅵ）concentrations in the solution at0，3，6，12，24and48h，and then the reduction rates of Cr（Ⅵ），the relative activities and relative stabilities of intracellular and extracellular enzymes were calculated.Using a multi-factor mixed experiment design，the temperatures were set as25℃，30℃，35℃，40℃，45℃，50℃，and the pH values were5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0；the red
uction rates of Cr（Ⅵ）by reductases at0，3，6and12h were calculated，then the effects of different temperatures and pH values on the reduction rate of reductase were analyzed，and the optimal reduction conditions were optimized.
0.2mmol·L－1Cu2+，Mn2+and Cd2+solution，1mmol·L－1SDS and EDTA，1%Triton X-100，Tween 80were added to the medium separately as treatment groups，and the untreated culture medium was used as control group.They were reacted with50mg·L－1Cr（Ⅵ）for3h under the optimal reduction conditions. The reduction rates of Cr（Ⅵ）were measured and calculated，and the changes of reduction rates in different metal ions and small molecules treatment groups were compared.Results：At3h，the reduction rates of Cr（Ⅵ）by intracellular and extracellular enzymes reached the highest，and the reduction ability of intracellular enzymes was higher than that of extracellular enzymes（P<0.05）.When the temperature was constant and the pH value was from5.0to6.0，the reduction rates of Cr（Ⅵ）by intracellular and extracellular enzymes were increased significantly；when the pH values were gradually increased，the reduction rates of Cr（Ⅵ）were decreased significantly.Under certain pH condition，with the increase of temperature，the intracellular enzyme reduction rates were gradually increased，and the extracellular enzyme reduction rates were decreased.The differences in reduction rates between different temperature an
d pH groups were statistically significant（P<0.05），and the interaction between temperature and pH was significant（P<0.05）.Compared with control group，the enzymatic reduction rate in Cu2+treatment group reached to46.4%（P<0.05），the reduction rates in Cd2+and Mn2+treatment groups were decreased （P<0.05）；there was no statistically significant difference in the reduction rate of Cr（Ⅵ）between small molecular substance Triton X-100and control group（P>0.05），while the reduction rates of Cr（Ⅵ）in Tween80，EDTA and SDS treatment groups were lower than that in control group（P<0.05）. Conclusion：The Cr（Ⅵ）reductase of strain S52can play a reducing role both inside and outside the cells，and the reducing effect of intracellular enzyme is stronger than that of extracellular enzyme.The optimal temperature of intracellular enzymes is35℃－45℃，and the optimal pH value is7.0；the optimal temperature of extracellular enzymes is25℃－30℃，and the optimal value is7.0.Different metal ions and
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吉林大学学报（医学版）
small molecules have different effects on the activities of reductases.
KEYWORDS Mesonia sp.S52；Cr（Ⅵ）；reductase；temperature；pH value；metal ions；small
molecule substances
铬（Chromium，Cr）是导致环境污染的主要重金属元素之一，金属电镀、纺织染和木材处理等工业生产活动中排放出来的污水中均含有Cr［1］。自然界中以三价铬［trivalent chromium，Cr（Ⅲ）］和六价铬［hexavalent chromium，Cr（Ⅵ）］最为稳定，但二者的性质大不相同。Cr（Ⅲ）毒性较小，微量的Cr（Ⅲ）是机体必需的营养物质；Cr（Ⅵ）溶解度更高，具有强烈的致癌、致畸和致突变性，其毒性比Cr（Ⅲ）高约100倍，致突变性高1000倍［2］，美国环境环保局已经把Cr（Ⅵ）确定为对人体最具威胁的17种化学物质之一［3］。人主要通过食物、饮用水摄入和空气等途径暴露于Cr［4］，皮肤及呼吸系统易受损害［5］。由于食物链的生物富集和放大作用［6］，因重金属等化学污染物排放造成的海洋污染，已致海产品面临食品安全问题［7］。针对福建省水产品中Cr蓄积情况的研究［8］显示：部分水产品样本存在Cr超标的现象。流行病学调查［9］显示：长期职业暴露于Cr也是肺癌高发的危险因素。因Cr（Ⅵ）污染而带来的公众健康问题日益突出，如何安全有效地去除或减少Cr（Ⅵ）污染，对保护生态平衡和人类健康具有重大意义。
Cr（Ⅵ）污染水体的主要治理方法有传统的物理化学方法和生物修复法。物理化学方法主要包括还原-离子交换法、吸附法和混凝法等，虽然处理效果尚可，但其存在反应过程复杂、成本高、副产物较多和易产生二次污染等不足［10］。生物修复法是一种新兴的、环境友好型的Cr（Ⅵ）污染水体修复技术，主要包括动物修复法、植物修复法和微生物修复法，具有过程安全、成本低、修复效率高和无二
次污染等优点，具有良好的发展前景［11］。pH值和温度一直被认为是微生物修复Cr（Ⅵ）的2个重要影响因素，可能影响着菌株内或者生物膜上有关蛋白酶的作用。pH值和温度影响菌株还原效率的相关研究已多见报道［12-13］，但大多停留在对还原菌株的筛选及其还原效率层面，鲜见对菌株胞内胞外活性物质分析及其最优还原条件探索的研究。
本课题组前期从厦门市大嶝岛双沪码头附近的海滩沉积物样品中成功分离筛选获得一株具有高效Cr（Ⅵ）还原能力的细菌Mesonia sp.S52，将其命名为海研站菌S52菌株（授权专利号：ZL201410819468.3）。在实验室条件下，该菌株最大耐Cr（Ⅵ）浓度为500mg·L－1，48h内对50mg·L－1Cr（Ⅵ）的还原率可达73%以上。本研究通过对S52菌株还原活性物质［Cr（Ⅵ）还原酶］进行提取和定位，同时探讨pH值和温度对Cr（Ⅵ）还原酶稳定性和活性的影响，以及不同金属离子和小分子物质对其还原效率的影响，旨在明确S52菌株还原Cr（Ⅵ）的途径及其机制，为后续微生物修复技术的优化提供理论依据。
1材料与方法
社保局24小时1.1菌株
菌株、、主要试剂和仪器
选用的实验菌株来源于本实验室从厦门市大嶝岛双沪码头附近的海滩沉积物样品中分离筛选并进行鉴定得到的海研站菌（Mesonia sp.）S52菌株。LB肉汤培养基（青岛海博生物技术有限公司），重铬酸钾、Triton X-100、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、丙酮、吐温80和十二烷基硫酸钠（SDS）等化学试剂均为分析纯。U410-86型超低温冰箱（美国NBS公司），Epoch2型全波长酶标仪（美国Biotek仪器有限公司），KQ3200B型超声波清洗仪（昆山超声仪器有限公司），THZ-C型恒温振荡器（江苏太仓强乐实验设备有限公司），EL204型电子天平和FE20型pH计（瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司），DNP-9052型恒温培养箱（厦门精艺兴业科技有限公司），VCX130PB型超声波破碎仪（美国Sonics公司），SW-CJ-2F型超净工作台（上海智诚分析仪器制造有限公司），MS-H-S型磁力搅拌器［大龙兴创实验仪器（北京）有限公司］，GI54TW型全自动灭菌锅［致微（厦门）仪器有限公司］，湘仪GL-21M离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）。
1.2种子液的制备
取保存于－80℃超低温冰箱中的S52菌液，平板划线法接种于LB固体培养基中，挑取分离纯化得到的S52单菌落于LB液体培养基中，37℃、160r·min－1恒温摇床培养12h即得S52种子液。
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李佳瑶，等.海研站菌S52菌株Cr(Ⅵ)还原酶活性和稳定性及其还原Cr(Ⅵ)的条件优化
1.3Cr（Ⅵ）还原酶的提取和定位
按4%接种量将S52种子液接种于LB液体培养基，过夜培养（12h）后，4℃、12000r·min－1离心５min，经0.22μm滤膜过滤后，收集上清液即为胞外活性物质（胞外酶）；用Tris-HCl缓冲液（pH值为8.0）洗涤菌体，再次离心去上清，重复3次，加入原培养基的1/20体积的Tris-HCl，漩涡振荡，转移到无菌玻璃容器中，用超声波破碎仪冰浴破菌，将破碎液4℃、12000r·min－1离心20min，取上清液到新的离心管中，即为胞内活性物质（胞内酶）［13-14］。将上述获得的胞内活性物质用Tris-HCl定容至与胞外活性物质的体积相同，与用作对照组的S52全菌体分别加入到含50mg·L－1Cr（Ⅵ）的培养体系中，37℃、pH值为8.0、160r·min－1摇床培养，于0、3、6、12、24和48h分别采用二苯碳酰二肼分光光度法分别测定溶液中Cr（Ⅵ）浓度，计算不同时刻Cr（Ⅵ）还原率。Cr（Ⅵ）还原率计算方法：实验初始Cr（Ⅵ）浓度记为ρ0，待测时点测得Cr（Ⅵ）浓度记为ρ1，待测时刻还原率Ｘ=（ρ0-ρ1）/ρ0×
100%，根据计算所得的Cr（Ⅵ）还原率判断Cr（Ⅵ）的还原情况。
1.4Cr（Ⅵ）还原酶的性质
1.4.1不同温度和不同pH值时Cr（Ⅵ）还原酶活性37℃、pH值为7.0条件下，将一定量的Cr（Ⅵ）还原酶（即胞外、胞内活性物质）与50mg·L－1Cr（Ⅵ）反应，3h后测定Cr（Ⅵ）浓度，将Cr（Ⅵ）浓度
的减少量作为活性测定的标准［15］，以相对活性指标来表示Cr（Ⅵ）还原酶活性，相对活性=不同条件下Cr（Ⅵ）浓度减少量/前述相对活性的标准×100%。保持pH值7.0不变，改变温度分别为25℃、30℃、35℃、40℃、45℃和50℃；在酶活性最高的37℃下，改变pH值为5.0、6.0、8.0、9.0和10.0，分别与50mg·L－1Cr（Ⅵ）反应，同样计算得出Cr（Ⅵ）还原酶相对活性。
1.4.2不同温度和不同pH值时Cr（Ⅵ）还原酶稳定性将一定量Cr（Ⅵ）还原酶置于4℃、pH值为7.0的LB培养基中24h后取出，在pH值7.0、37℃条件下与50mg·L－1Cr（Ⅵ）反应，3h后测定Cr（Ⅵ）浓度，将Cr（Ⅵ）浓度的减少量作为相对稳定性的标准［15］，以相对稳定性指标来表示Cr（Ⅵ）还原酶稳定性，相对稳定性=不同条件下
Cr（Ⅵ）浓度减少量/前述相对稳定性的标准×100%。保持pH值7.0不变，改变温度分别为25℃、30℃、35℃、40℃、45℃和50℃；4℃条件下将pH值分别改为5.0、6.0、8.0、9.0和10.0，24h后分别与50mg·L－1Cr（Ⅵ）在37℃条件下反应，同样计算得出Cr（Ⅵ）还原酶相对稳定性。
1.5二苯碳酰二肼分光光度法测定Cr（Ⅵ）浓度
参照《生活饮用水标准检测方法金属指标》（GBT5750.6-2006），测定Cr（Ⅵ）浓度。
1.6二苯碳酰二肼分光光度法测定不同温度和不同pH值组Cr（Ⅵ）还原酶对Cr（Ⅵ）的还原率
将温度设为25℃、30℃、35℃、40℃、45℃和50℃，pH值设为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0。采用混合实验设计，将各个温度水平与pH值水平完全随机组合（6×6），实验组总共设为36组，同时各设3组平行对照。分别以4%接种量接种S52种子液于含50mg·L－1Cr（Ⅵ）的培养基中，不同温度和不同pH值条件下，同时置于160r·min－1恒温摇床中震荡培养，在0、3、6和12h分别采用二苯碳酰二肼分光光度法测定Cr（Ⅵ）浓度并计算各个时刻的Cr（Ⅵ）还原率。采用方差分析和多重比较等统计学方法，分析S52菌株的Cr（Ⅵ）还原酶还原Cr（Ⅵ）的最适宜温度和pH值，拟合出最优还原条件。
1.7二苯碳酰二肼分光光度法测定不同金属离子处理组Cr（Ⅵ）还原酶对Cr（Ⅵ）的还原率
分别将浓度为0.2mmol·L－1的Cu2+、Mn2+和Cd2+溶液加入到LB液体培养基中作为处理组，以未作处理的培养基作为对照组，在“1.6”中得到的最优还原条件下与50mg·L－1的Cr（Ⅵ）反应3h，采用二苯碳酰二肼分光光度法测定Cr（Ⅵ）浓度，比较不同金属离子处理组Cr（Ⅵ）还原酶对Cr（Ⅵ）的还原率。
1.8二苯碳酰二肼分光光度法测定不同小分子物质处理组Cr（Ⅵ）还原酶对Cr（Ⅵ）的还原率
分别将浓度为1mmol·L－1的SDS、EDTA和1%的Triton100、吐温80加入到LB液体培养基中作为处理组，以未做处理的培养基作为对照组，在“1.6”中得到的最优还原条件下与50mg·L－1的Cr（Ⅵ）反应3h，用二苯碳酰二肼分光光度法测定Cr（Ⅵ）浓度，比较不同小分子物质处理组Cr（Ⅵ）还原酶对Cr
（Ⅵ）的还原率。
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1.9统计学分析
采用SPSS20.0统计软件进行统计学分析，应用Excel2018软件绘制图表。Cr（Ⅵ）还原酶对Cr（Ⅵ）的还原率、Cr（Ⅵ）还原酶相对活性和相对稳定性均符合正态分布并且方差齐，以x±s 表示，不同温度和不同pH值处理组间比较采用析因方差分析和多重比较，不同金属离子和小分子物质处理组多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1Cr（Ⅵ）还原酶的提取和定位
随着时间延长，S52原菌体对Cr（Ⅵ）的还原率不断升高，48h时对50mg·L－1Cr（Ⅵ）的还原率可达73.1%；3h时，胞内酶和胞外酶对Cr（Ⅵ）的还原率达到最高，且胞内酶对Cr（Ⅵ）
的还原率高于胞外酶（P<0.05）；随后Cr（Ⅵ）还原率不断降低，相同时间点胞内酶和胞外酶的对Cr（Ⅵ）的还原率比较差异无统计学意义（P> 0.05），但与对照组比较差异均有统计学意义（P<0.05），12h后Cr（Ⅵ）还原率几乎为0，且12、24和48h间Cr（Ⅵ）还原率比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。
2.2Cr（Ⅵ）还原酶的性质
2.2.1不同温度时胞内酶和胞外酶的相对活性和稳定性对于胞内酶，保持良好活性的温度范围为35℃~45℃，若将其预先置于45℃~50℃条件下24h可能会引起酶的不稳定，同时影响酶活性（图1A）；对于胞外酶，在25℃~30℃时较适合其酶活性发挥，4℃~30℃稳定性较好，且不同温度间差别不明显（图1B）。因此胞内酶最适温度为35℃~45℃，胞外酶最适温度为25℃~30℃。
2.2.2不同pH值时胞内酶和胞外酶的相对活性和稳定性当pH值<7.0或pH值>7.0时，胞内酶的酶活性或稳定性会有较大损失，因此胞内酶的最适pH值为7.0；当pH值在7.0~8.0时，胞外酶的稳定性较好，但当pH值>7.0时，酶活性有一定损失，因此胞外酶的最适pH值也为7.0。见图2。
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2.3不同温度和不同pH值条件下胞内酶对Cr（Ⅵ）的还原率浙江省温州市天气
随着时间延长，不同温度和不同pH值条件下胞内酶对Cr（Ⅵ）的还原率均逐渐降低，12h时所有组未
见明显还原效果。作用3h时，相同温度下，pH值从5.0到6.0，胞内酶对Cr（Ⅵ）的还原率明显升高；随着pH值升高，其还原率大幅降低。在一定pH值条件下，温度从25℃~45℃，胞内酶对Cr（Ⅵ）的还原率逐渐升高。在45℃、pH值6.0条件下，胞内酶对Cr（Ⅵ）的还原率最高，达到39.7%。采用析因设计资料方差分析，不同pH值组间胞内酶对Cr（Ⅵ）的还原率比较差异有统计学意义（F=201.748，P<0.05）；结合多重比较，当pH值为6时，胞内酶对Cr（Ⅵ）的还原率高于其他pH值组（P<0.05）；不同温度组间胞内酶对Cr（Ⅵ）的还原率比较差异有统计学意义（F= 44.671，P<0.05），温度为40℃和45℃组胞内酶对Cr（Ⅵ）的还原率均高于其他组（P<0.05），但其2组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。温度和pH值具有明显的交互效应（P<0.05）。见表2。
2.4不同温度和不同pH值条件下胞外酶对Cr（Ⅵ）的还原率
广州到北京旅游团报价五日游随着时间延长，不同温度和不同pH值条件下胞外酶对Cr（Ⅵ）的还原率均逐渐降低，12h时所有组均未见明显还原效果。作用3h时，温度一定
表1不同时间点S52菌株胞内酶和胞外酶对Cr(Ⅵ)的还原率
Tab
Tab..1Cr
Reduction rates of Cr((Ⅵ)S
by intracellular and extracellular enzymes in S5252strain at different time points
（n=3，x±s,η/%）
Group
Control Intracellular enzyme Extracellular enzyme
Reduction rate of Cr(Ⅵ)
(t/h)3
1.8±0.5
18.1±1.3*△
10.8±1.5*
6
6.1±1.2
3.2±0.9*
2.7±0.5*
12
11.8±1.9
0.2±0.1*
0.1±0.2*
24
26.9±3.1
0.0±0.0*
0.8±0.1*
48
73.1±4.3
0.6±0.1*
0.0±0.0*
*P<0.05compared with control group；△P<0.05compared with extracellular enzyme. 48
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