新城疫（newcastle disease ，ND ）是由新城疫病毒（newcas-tle disease virus ，NDV ）强毒株引起的、以感染禽类为主的一种急性、热性、败血性和高度接触性传染病[1]，具有很高的发病率和死亡率，在全球范围内广泛流行，曾在世界范围内引起三次大的流行，给养禽业造成了巨大的经济损失，严重影响了养禽业的发展，该病与高致病性禽流感并列为世界公认的最重要的2个禽类疫病[2,3]。世界动物卫生组织（OIE ）将新城疫列为A 类疫病，我国将其列入一类动物疫病[4]。 目前检测新城疫病毒的常用方法为荧光定量RT-PCR ，该方法比常规的检测方法用时少、周期短、灵敏、准确、特异性强、操作简便[5]， 且不易引起污染，还可用于病毒的定量分析。在检测过程中，提取核酸是关键环节，因为提取后的核酸质量及其完整性会直接影响到后续试验结果[6]。本研究选用实验室常用的磁珠法和柱式法提取病毒核酸进行荧光定量RT-PCR 检测，发现两种提取方法在灵敏度及重复性等方面存在差异。现将研究结果报告如下。 1材料与方法
1.1材料
1.1.1主要仪器与设备King Fisher Flex 96通道全自动核酸提取仪，微量移液器，MIKRO 200R 高速冷冻离心机，BIO-RAD CFX Connect 荧光定量PCR 仪。
1.1.2检测试剂新城疫病毒荧光RT-PCR 试剂盒，购自深圳澳东检验检测科技有限公司，批号：66080；病毒核酸（RNA ）抽提试剂盒（离心柱式），购自深圳澳东检验检测科技有限公司，批号：69015；病毒核酸提取试剂（磁珠法），购自广州和实生物技术有限公司，批号：CZD00412。
1.1.3样品2020年主要禽病流行病学调查及监测中，筛查出的新城疫阳性样品（鸡咽泄拭子和环境拭子），共22份。
1.2方法
1.2.1磁珠法将拭子样品混匀，静置3～5min ，取200μL 上
清，由KingFisher Flex 96通道全自动核酸提取仪提取核酸，最后获得100μL RNA 溶液。
云南旅游一周大概要花多少钱1.2.2柱式法将拭子样品混匀，静置3～5min ，取100μL 上清到1.5mL 洁净离心管中，加入200μL 裂解液、3μL Carrier RNA ，涡旋混匀20s ，室温静置5min ，然后加入150μL 无水乙醇，颠倒混匀，短暂低速离心除去管盖上的液体，小心将混合液体转移至纯化柱管内，12,000rpm 离心1min ，倒弃废液收集管内液体。打开管盖，加入450μL 洗液1，12,000rpm 离心1min ，倒弃废液收集管内液体；打开管盖，加入500μL 洗液2，12,000rpm 离心1min ，倒弃废液收集管内液体；再加入500μL 无水乙醇，12,000rpm 离心1min ，倒弃废液收集管内液体，再于12,000rpm 离心3min ，丢弃废液收集管。将纯
化柱取出放进1.5mL 洁净的离心管中，打开管盖，室温干燥3min 后，向膜片中央小心加入50μL 洗脱液，室温放置1min ，12,000rpm 离心1min ，最后获得50μL RNA 溶液。
1.2.3荧光RT-PCR 法PCR 各个组分所需要的量，按（n+1）公式计算，然后分别吸取混入同一灭菌1.5mL 进口离心管中，涡旋振荡、瞬时离心后，分装至PCR 反应管中。向PCR 反应管中加入5μL 核酸，标明位置后放入BIO-RAD CFX Connect 荧光定量PCR 仪，按试剂盒说明书编程运行。
2结果
根据试剂盒说明书，磁珠法吸取200μL 样品，加100μL Elution buffer ，最后获得100μL RNA 溶液；柱式法吸取100μL 样品，加50μL Elution buffer ，最后获得50μL RNA 溶液。两种提取方法样品用量与获得核酸体积比例相当。以每种提取方法3次平行提取病毒RNA 为模板，每次用同种荧光RT-PCR 试剂进行扩增。结果显示，磁珠法提取核酸的荧光RT-PCR 结果成功率较高，3次检测，阳性率均为100%。结果见表1。
从每种提取方法的3次平行荧光RT-PCR 检测中，各选取一张扩增效果较好的曲线图（见图1、图2），其中磁珠法提取核酸荧光RT-PCR 阳性样品的Ct 值范围为13.46～29.81（阳性对照Ct 值：19.70）；柱式法提取核酸荧光RT-PCR 阳性样品的Ct 值范围为17.09～31.23（阳性对照Ct 值：20.11）。
3讨论
3.1磁珠法提取核酸的检测灵敏度较高
磁珠法和柱式法提取核酸在新城疫荧光定量检测中的比较
王军，何长生，王维，王倩，周迎春*
（安徽省动物疫病预防与控制中心合肥230091
）
试验旨在分析比较磁珠法和柱式法提取病毒核酸的灵敏度及重复性。试验选用实验室常用的磁珠法和柱式法试剂同时提取核酸检测新城疫阳性样品，荧光相对定量比较两种方法的灵敏度及重复性。结果表明，磁珠法提取核酸的检测灵敏度较高，重复性较好，检测成功率较高。表明磁珠法提取核酸在新城疫的荧光定量检测中优于柱式法
。
疫；磁珠法；柱式法；荧光R T -PCR
作者简介：王军（1983—），安徽合肥人，兽医师，硕士，主要从事动物疫病防控工作。
*通讯作者：周迎春，硕士，主要从事动物疫病防控工
作。
doi:10.3969/j.issn.1008-4754.2021.03.068
佛山西樵山南海观音根据表1，对于22份新城疫阳性待检样品，磁珠法提取核酸的荧光RT-PCR 检测结果全部为阳性，检出率达100%，而柱式法提取核酸的荧光RT-PCR 检测结果较好的一次，检出率仅达86.36%（19/22）；由图1和图2可知，磁珠法提取核酸的荧光RT-PCR 扩增曲线较好，反映出所提取核酸的浓度及纯度较高。这表明磁珠法提取核酸的检测灵敏度较高。对于检测一些病毒含量较低的样品而言，选择磁珠法提取核酸，可以避免因核酸提取效率低导致荧光RT-PCR 结果假阴性的出现，能够减少新城疫疫情诊断的失误。
3.2磁珠法提取核酸的检测重复性较好
由表1可知，3次平行检测，磁珠法提取核酸的荧光RT-PCR 检出率均为100%，检测结果一致。这表明磁珠法提取核酸的检测
重复性较好。究其原因，应该与磁珠法提取原理及用机器代替人工进行全自动操作有关。在提取过程中磁珠的大表面积与目标核酸特异性地识别和高效结合，使其具有优越的洗脱效率，可有效提高提取核酸的浓度及纯度。
3.3加强磁珠法在新城疫病毒核酸提取中的应用
烟台免费55个旅游景点做好新城疫监测工作，可为新城疫疫情预警预报提供有效技术支撑，是现阶段降低新城疫流行的重要手段。通过本研究发现，磁珠法提取核酸在新城疫的荧光定量检测中优于柱式法。在当前普遍采用荧光RT-PCR 检测方法
的背景下，选择提取效率较高的核酸提取方法，可有效保证检测结果的准确性，因此建议
各兽医实验室加强磁珠法在新城疫病毒核酸提取中的应用。█
参考文献：
[1]王志亮，刘华雷.新城疫[M].北京：中国农业出版社,2012.
[2]蔡静，黄潆艺，刘俊显，等.鸡新城疫流行原因分析及防控[J].动物医学进展,2017,38(4):113-116.
[3]王军，周迎春，陈曦，等.安徽省2015年新城疫集中监测与分析[J].中国畜禽种业,2016,12(7):5-7.
国家博物馆
[4]朱钱龙，方霞，尧国荣，等.鸡新城疫流行状况及防控研究进展[J].畜牧与饲料科学,2017,38(6):110-112.
[5]杨丽丽，邹冬辉.新城疫病毒检测方法的研究进展[J].吉林农业,2015,19(10):90-91.
[6]王淼，马学军.核酸提取方法的研究进展[J].中华实验和临床病毒学杂志,2014(6):503-505.
图1磁珠法提取核酸荧光RT-PCR 扩增曲线
图2柱式法提取核酸荧光RT-PCR 扩增曲
线
通过利用棕榈核仁粕和椰子粕配制猪饲料，发现日粮含有的棕榈核仁粕和椰子粕成分达到了20%，提高了肥育猪的生产性能。此外，当猪饲料内椰子粕含量达到10%时，发现试验组的肥育猪生产性能明
显低于对照组，随着椰子粕含量不断增加，肥育猪采食量不断下降，在保证饲养合格的前提下，发现肥育猪背膘厚不断下降，而脂肪酸、硬脂酸、亚油酸呈现出不断增长的趋势，由此可见猪饲料中椰子粕含量直接影响了肥育猪的背膘脂肪酸成分。
5结束语
目前，我国豆粕资源日益短缺，且价格昂贵，如果利用豆粕配制猪饲料，势必会增加肥育猪的饲养成本，严重影响畜牧业的社会效益和经济效益。为了解决这一问题，畜牧业要加大对棕榈核
仁粕和椰子粕的应用和推广，利用棕榈核仁粕和椰子粕代替豆粕，以实现对猪饲料的科学配制，这样一来，不仅有效地缓解了豆粕资源短缺问题，还提高肥育猪饲养效益，为尽可能降低肥育猪饲养成本，提高畜牧业的社会效益和经济效益提供有力的保障。█
参考文献：
大同方特欢乐世界[1]程时军，张伟.棕榈粕和椰子粕在畜牧行业中的应用[J].饲料与畜牧,2010
(5):39-41.
对照组
415
1205
835
2546
0.572
3.05
1824
574
黑龙江好玩的地方2494
0.700
4.34
组别前期（kg ）
后期（kg ）表3 各组增重及耗料情况
表1 两种提取方法检测新城疫荧光RT-PCR 阳性率的比较类别磁珠法
柱式法
