2021 年 1 月 Vol. 39 No.1
January 2021
Chinese Journal of Chromatography
87 〜95
青年编委专辑(上)•研究论文
DOI ： 10.3724/SP.J. 1123.2020.05028
李健民，卓越，张毅达，李娜，伍建林*
(澳门科技大学中医药学院，中药质量研究国家重点实验室，澳门999078)
摘要:LC-MS 联用技术在蛋白质组学研究中具有重要的作用，但是在复杂的生物体系中，由于样品的高度复杂性和
成都洛带古镇景点介绍其中蛋白质含量的巨大差异，执行全面且无倾向的蛋白质组分析是一项挑战。因此，在液相谱分离中采用基于 不同原理的谱分离方法来降低蛋白质样本的复杂度，并对微量蛋白质进行富集，对后续采用质谱方法进行信息 的采集和深入分析至关重要。在这里我们开发了一种基于尺寸排阻谱(SEC )与反相液相谱(RPLC )结合的新 方法来进行复杂体系蛋白质的分离和鉴定，特别是对于微量蛋白质的分析。首先使用SEC 对蛋白质进行分离和富 集，并酶解成多肽，再通过RPLC-MS 联用的方法对酶解后的多肽进行分离和鉴定。结果显示使用上述方法可以有
效降低蛋白质样本的复杂度，并有效提高微量蛋白质的鉴定能力，可从大鼠肾脏鉴定出23 621个肽段及1 345个 蛋白质，比常规的二维强阳离子交换-反相液相谱法(2D SCX-RPLC)鉴定到的肽段及蛋白质分别多出69%及 27%。此外，该方法对肾脏翻译后修饰(PTM)蛋白质的鉴定显示出更多的优势，翻译后修饰的多肽鉴定率显著增 力口，特别是磷酸化肽段的鉴定效率可达到靶向富集策略的水平。在此展示的SEC-RPLC-MS 可以更好地了解蛋白 质翻译后修饰对肾脏的影响，最终将有助于增加我们对正常的生理性肾功能以及病理过程机制的理解。
关键词：蛋白质组学；尺寸排阻谱；翻译后修饰
收稿日期：2020-05-29
* 通讯联系人.Tel ：(0853)88972406,E-mail ：jlwu@ . 基金项目：澳门特别行政区科学技术发展基金会(0090/2018/A3).
Foundation item ： the Science and Technology Development Fund, Macau SAR (No. 0090/2018/A3).
中图分类号：O658 文献标识码:A 文章编号：1000-8713(2021)01-0087-09
Size exclusion-reverse liquid column chromatography-mass spectrometry and its application in the identification of
post-translationally modified proteins in rat kidney
LI Jianmin , ZHUO Yue , ZHANG Yida , LI Na , WU Jianlin *
(Faculty of Chinese Medicine , State Key Laboratory of Quality Research in Chinese Medicine ,
Macau University of Science and Technology , Macau 999078, China)
Abstract : Proteomics is an emerging field that has been shown to play a crucial role in
unveiling the mechanisms underlying physiological and pathological processes , and liquid chro matography-mass spectrometry (LC-MS ) is one of the most important methods employed in this field ． However , in complex biological systems , such as eukaryotes , it is challenging to per form a comprehensive and unbiased proteome analysis due to the high complexity of biological samples and enormous differences in sample contents ． For example , post-translational modifi cations ( PTMs ) in proteins are imperative for cell signaling , but post-translationally modified proteins account for about 1 % of the total proteins in a single cell , making their identification extremely difficult ． Therefore , chromatographic separation methods based on different princi ples are generally applied to reduce the complexity of biological samples and enrich trace pro teins for their identification through mass spectrometry ( MS ) ． In this study , we developed a new proteomics method by combining size exclusion chromatography ( SEC ) and reversed-
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伍建林：博士，现任澳门科技大学中药质量研究国家重点实验室副教授，博士生导
师，广州医科大学南山学者特聘教授（2017-2020）o2004年获日本新潟大学工学
部工学硕士（NMR应用），2009年获香港浸会大学化学系哲学博士（MS应用），
后在香港大学李嘉诚医学院从事博士后研究员工作并筹建了基于LC、MS和NMR
的香港大学代谢组学与先端分析实验室，2011年加入澳门科技大学任助理教授，
筹建了基于LC、MS和NMR的包括组学技术与创新药物研究中心和澳门核磁共
振与光谱中心。目前主要从事多组学整合分析方法研究消化道肿瘤机制、药物和
食品化学分析及应用等。截至目前，以第一和通讯作者（含共同）在Cell Res，
Gastroenterology，Anal Chem，J Hazard Mater，Environ Int，Food Chem，J
Agric Food Chem和J Nat Prod等，及合作在J Hepatol，Gastroenterology，Adv
Sci等杂志上发表LC、MS和NMR应用相关SCI文章80余篇，授权国际发明专利
5项。
phase chromatography(RPLC),to separate and identify trace proteins in complex systems.
黔西十大旅游景点SEC was used to separate and enrich kidney-specific proteins.After optimization of the method,it was found that30mmol L of ammonium acetate could efficiently separate rat kidney proteins from the total protein fraction so that they could be eluted based on their relative molecular mass.Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)analysis and LC-MS results showed that our SEC separation method not only refined the protein composition of the biological sample but also enhanced the relative contents of trace proteins through multiple injections.The collected protein fractions were further concentrated through ultrafiltration centrifugation followed by freeze-drying,which further improved the recovery of trace proteins by approximately90%and largely decreased the time required with the use of freezedrying alone.Thereafter,five protein fractions were separately digested using trypsin,and the resultant peptides were further analyzed by reverse phase chromatography-MS analysis.In the RPLC column,the peptides were isolated mainly based on their hydrophobicity.As a result,by combining SEC and RPLC,23621peptides and1345proteins were identified from the kidney, with an increase in numbers by69%and27%,respectively,when compared to those obtained using the common2D strong cation exchange(SCX)-RPLC-MS method.However,no significant difference was observed in the pI and grand average of hydropathicity(GRAVY)values.
Gene ontology(GO)analysis revealed an increase in the number of proteins in each cell component,especially the membrane.Furthermore,identification of a higher rate of identified peptides than proteins suggested that the protein coverage was also improved,thereby facilitating the detection of PTM proteins.Consequently,five common PTMs in biological processes,including methylation,acetylation,carbamylation,oxidation,and phosphorylation,were examined and compared between the two methods.As expected,the number of post-translationally modified peptides identified using SEC-RPLC-MS were 1.7-1.9times more than those determined using the SCX-RPLC-MS method.Especially for the identification of phosphorylated peptides, we could achieve the level of the targeted enrichment strategy；however no significant difference was observed in the extents of phosphorylation among serine,threonine,and tyrosine. These results further indicate that upon combining SEC and RPLC,high efficiency could be achieved by decreasing the complexity of the protein sample,and the identification was unbiased.Finally,the phosphorylation of some kidney proteins,such as spectrin,L-lactate dehydrogenase,and ATPases,was found,which is critical for their functions.In summary,the
李健民，等：尺寸排阻-反相液相谱-质谱联用技术在大鼠肾脏
翻译后修饰蛋白质鉴定中的应用
第1期・89・SEC-RPLC-MS approach was developed for the identification of rat kidney proteins and is especially applicable for the identification of PTM proteins．Using this method,the identification efficiency for PTM peptides increased significantly．Therefore,this method has potential for better understanding the impact of PTM on kidney proteins and further elucidating the potential mechanisms underlying its physiological and pathological functions．
Key words:proteomics；size exclusion chromatography(SEC)；post-translational modification(PTM)
蛋白质组学研究近年来引起了越来越多的关注，并且处于技术发展阶段［1］。蛋白质组学的主要挑战是鉴定高度复杂、宽动态范围样品中的低丰度蛋白质，由于样品的复杂性和广泛的动态范围，执行无差别的蛋白质组分析是一项非凡的挑战。传统的一维液相谱（1D-LC）通常无法为复杂样品的分析提供足够的分离能力［2,3］，这激发了不同液相谱技术（例如二维液相谱,2D-LC）［4］组合的发展。在2D-LC中，收集来自第一维液相谱（第一液相谱）的流分，然后将其重新注入第二维液相谱（第二液相谱）［5,6］，两种不同的分离方法相结合可以获得更高的分离效率［7］。如2D强阳离子交换-反相液相谱法（2D SCX-RPLC），由于SCX谱柱上的静电相互作用和C18谱柱上的疏水相互作用相结合，具有较高的检测灵敏度和出的分离性能，广泛应用于自下而上的鸟法蛋白质组学当中［8,9］
尺寸排阻谱法（SEC）是一种广泛用于蛋白质分离纯化的传统技术，该技术主要用于制备纯化和脱盐，尤其是在分子生物学中，该技术被大量用于生产纯净蛋白质［10-13］。反相液相谱（RPLC）由于其多功能性、灵活性和耐用性，是分析多肽及蛋白质的主要方法之一［14］。肽段进入反相谱柱后，利用肽段的疏水性，根据不同分配系数依次流出，实现肽段分离。利用SEC对蛋白质进行分离纯化，不仅可以降低样品复杂度，并且可以对复杂蛋白质样品中的低丰度蛋白质进行富集，再结合RPLC进行肽段分离实现肽段分析。
蛋白质的翻译后修饰（PTM）是具有许多生物学功能的细胞蛋白质的重要调控机制之一。蛋白质的翻译后修饰广泛存在于各种细胞器的蛋白质中，并且在不同种类细胞器中具有不同的生物功能［15］。随着质谱技术的广泛应用，这些化学修饰在蛋白质质量上的变化能被精确地检测到，并且能进行大规模、全面的PTM筛选，以实现对蛋白质生理研究以及疾病预防更深入的了解。迄今为止，已鉴定 出超过450种独特的蛋白质修饰，包括磷酸化、乙酰化、氨基甲酰化、氧化等，它们可以通过翻译后修饰改变目标蛋白质的活性、分布、相互作用及寿命［16］。每个细胞当中具有翻译后修饰的蛋白质总量约占单个细胞总蛋白质的1%［17-20］，且蛋白质浓度的差异甚至可以达到数百万至数十亿倍，所以鉴定低浓度蛋白质及该类蛋白质的翻译后修饰需要更灵敏、准确的分离及检测方法。肾脏作为重要的排泄器官，它的基本功能是生成尿液，借以清除体内代谢产物及某些废物、毒物，同时经重吸收功能保留水分及其他有用物质，而PTM参与肾脏中各种细胞过程和信号传导途径［21-27］。最近的
研究表明肾脏缝隙隔膜、足细胞、神经节和足突的局部粘着可能存在蛋白质修饰［22-26,28］。这些肾脏中的蛋白质修饰，不仅在肾小球超滤功能中，而且在肾稳态调节过程中也起着关键作用。而磷酸化修饰作为最普遍的PTM，几乎与每个细胞过程密切相关［29］，它在调节多种代谢酶的活性中起关键作用［30］，如协调激活ATP合酶为细胞提供能量维持细胞正常运作等［31］。
为了鉴定更多的大鼠肾脏蛋白质以及翻译后修饰的蛋白质，我们构建了SEC-RPLC-MS系统，采用SEC对肾脏蛋白质样品进行预分离，降低样品蛋白质复杂度，并使用nano-RPLC-MS对预分离蛋白质的胰蛋白酶解肽进行分离和鉴定。
1实验部分
1.1材料与仪器
醋酸铵、磷酸化盐、乙腈（均来自美国Sigma-Aldrich公司）；二硫苏糖醇（DTT），碘乙酰胺（IAA）和尿素（来自美国GE Healthcare公司）。胰蛋白酶（质谱纯）（来自美国Thermo Fisher Scientific）。Dionex Ultimate3000RSLC UPLC&Bruker maXis Impact Q-TOF-MS串联质谱；ST-16R型高速冷冻离心机（美国Thermo公司）；水由Milli-Q
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Ultrapure水系统(美国Millipore公司)生产。
1.2样品制备
实验大鼠是购自香港中文大学的Sprague-Dawley(SD)大鼠，并在澳门科技大学的动物房中繁殖。选用8周龄的雄性SD大鼠(225g)，麻醉后生理盐水腹腔主静脉灌注洗净血液，取出肾脏用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗净。横向切取右肾组织100 mg，加入1mL PBS匀浆，离心后取上清液。300 x L上清液加入1200x L冷丙酮沉淀,6000r/min 下离心5min，取蛋白质沉淀。蛋白质沉淀加入300 x L PBS复溶,12000r/min下离心10min后取290 x L上清液待用。
1.3肾脏蛋白质SEC预分离
收集肾蛋白质上清液采用BCA(bicinchoninic acid)方法测定蛋白质浓度后，使用Agilent1100 system制备液相系统将290x L(827.5x g)肾蛋白质溶液进行SEC预分离。对于SEC，使用Phe-nomenex(美国Torrance公司)的BioSep-SEC-3000谱柱(300mm x7.8mm)、Cartridges GFC 3000保护柱(3.0mm x4mm)o流动相为30 mmol/L醋酸铵(pH值调至7)，流速为1mL/min，在280nm处进行吸光度检测，依次收集蛋白质流分。回收的蛋白质流分使用Millipore超滤离心管(3K,15mL)在4000g下离心浓缩45min，转移浓缩液至离心管内。冷冻后，使用冷冻离心干燥机除去剩余的液体，收集蛋白质粉末。
1.4蛋白质酶解
收集的预分离肾脏蛋白质粉末加入100x L8 mol/L尿素进行复溶，12000r/min下离心5min 后取上清液，使用BCA方法测定蛋白质浓度。取总蛋白质质量为100x g的上清，在室温下用DTT (200mmol/L)还原60min。加入IAA(1mol/L)，转移至黑暗中孵育60min。反应混合物在室温下用DTT(200mmol/L)淬灭60min。力口入25 mmol/L的碳酸铵溶液，直到尿素浓度低于1 mol/L。最后，加入2x g胰蛋白酶，在37贮烘箱消化过夜。用SPE C18柱实现消化液除盐，洗脱液在氮气下干燥。
1.5nano-RPLC-Q-TOF-MS
用50x L2%乙腈(含0.1%三氟乙酸，v/v)溶解胰蛋白酶解肽,12000r/min下离心10min后取上清液进样。使用Ultimate3000RSLC UPLC(Di-onex)与maXis Impact Q-TOF-MS(Bruker)串联系统实现肽段分离和鉴定，正离子模式使用Bruker Advance CaptiveSpray离子源。上清液上样到Acclaim PepMap100nanoViper C18捕获柱(2cm x75x m,3x m,Thermo)。然后在Acclaim Pep-Map RSLC nanoViper C18分析柱(15cm x75x m, 2x m,Thermo)上以300nL/min的流速分离肽段。流动相由(A)水中含0.1%甲酸(FA)和(B)乙腈中含0.1%FA组成，梯度如下：0〜8.0min,5%B；8.0〜110.0min,B从5%线性增加到40%；110.0〜110.1min,B从40%线性增加到80%；110.1〜115.0min,80%B；115.0-115.1min，恢复至5% B；115.1〜120.0min,5%B。进样量为1x L。质谱用正离子模式下的Bruker Advance CaptiveS-pray离子源。干燥气的温度为160贮，流速为4.0 L/min。端板偏移和毛细管电压分别设置为500V 和1400V。在m/z330和1400之间的范围内选择了前10个前体离子，并且排除了带单电
荷的离子，而MS/MS分析首选带电状态为+2、+3和+4的前体离子。
1.6蛋白质鉴定
使用Data Analysis软件处理MS数据导出的. mgf文件，将该.mgf数据导入MASCOT搜索引擎中，数据库为Swiss-Prot51.6。选择胰蛋白酶作为酶；固定修饰为carbamidomethyl(C)，可变修饰为Phospho-S、Phospho-T、Phospho-Y、Acetyl-K、Carbamyl-K、Methyl-DE、Oxidation-M等7个修饰；前体离子和MS/MS允许误差范围分别设定为30x 10_6(30ppm)和0.2Da；肽电荷为2+、3+和4+。
2结果与讨论
我们了构建SEC-RPLC系统，采用SEC对肾脏蛋白质样品进行预分离，降低样品蛋白质复杂度，从而提高低丰度蛋白质的检测灵敏度。
2.1SEC流动相优化及流分浓缩
2.1.1SEC流动相优化
为提高尺寸排阻谱对蛋白质的分离能力，首先对流动相进行了优化。20x L肾脏蛋白质溶液(2.85xg/x L)进样，分别使用30mmol/L醋酸铵、10mmol/L PBS或Milli-Q水作为流动相进行分离，检测
波长为280nm。在尺寸排阻谱柱中，蛋白质是根据其在流动相中流体动力学体积的差异，通过扩散进出停滞的孔而分离出来的。具有中等离子强度的非变性水性缓冲液(如醋酸铵、磷酸缓冲
李健民，等：尺寸排阻-反相液相谱-质谱联用技术在大鼠肾脏
翻译后修饰蛋白质鉴定中的应用
第1期-91-
盐溶液等），通常用于最大程度减少蛋白质与固定相表面的非特异性相互作用［32,33］。PBS因能有效提高蛋白质在SEC的分离效率而被广泛应用［34］，但缺点是非挥发性盐的残留在后续的质谱检测时会导致质谱损伤；醋酸铵作为挥发性盐被广泛应用到LC-MS串联质谱上，可在提高SEC蛋白质分离效率的同时保证蛋白质结构及活性［35］，且作为挥发性盐可避免对仪器的损伤。我们的结果表明，使用醋酸铵的液相谱图可显示更多的单独谱峰，峰形更完整，具有更高的分离效率（见图1a），故采用质谱兼容的醋酸铵作为流动相盐。
接下来，对流动相的盐浓度进行了优化，醋酸铵浓度分别为10,30和50mmol/L。结果显示30 mmol/L醋酸铵分离效率高于10mmol/L醋酸铵，提示适当提高盐浓度可减少蛋白质表面的电荷数量，减少蛋白质与填料表面可能的吸附［36］。50 mmol/L的分离效果却低于30mmol/L醋酸铵的分离效果（见图1b）
。虽然缓冲盐能抑制蛋白质与填料之间的静电效应，但提高盐浓度也会增强蛋白质与谱柱填料的疏水相互作用（通常在高盐浓度下占主导地位），影响蛋白质分离效果［36,37］。为了最佳的分离效率，及减少盐浓度便于后续实验处理,
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图1尺寸排阻谱流动相的优化
Fig.1Optimization of size exclusion chromatography (SEC)mobile phase
a.buffers；
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HAc:ammonium acetate；PBS:phosphate buffer solution.采用30mmol/L醋酸铵作为流动相。
2.1.2蛋白质流分的浓缩
在SEC分离肾脏蛋白质前及浓缩富集后，分另U 测定蛋白质的量并计算回收率。常规的流分浓缩方法是收集流分后进行冷冻干燥，回收率仅为75.74%，其可能由于样品较大的体积，在处理过程中与容器壁接触面积较大导致样品损失严重；并且该方法所需时间过长，每次冷冻干燥需要20h以上。为了降低蛋白质损失及减少所需时间，先使用超滤离心管（3K）对样品进行浓缩，将浓缩的蛋白质溶液进行冷冻干燥，可将浓缩时间降至6~7h。使用超滤离心管-冷冻干燥方法的蛋白质回收率可以达到89.67%，高于仅使用冷冻干燥浓缩的方法（75.74%）。后续实验均采用超滤离心管-冷冻干燥的方法进行流分浓缩。
2.2SEC-RPLC方法
2.2.1样品复杂度分析
组织蛋白质组成较血清、细胞蛋白质更为复杂，在当前的研究中，我们测试了使用SEC对组织来源的蛋白质进行预分流来降低样品复杂性的效率。
为了确定尺寸排阻谱的分离效果，经过SEC 分离的蛋白质流分用尿素复溶后，进行SDS-PAGE （sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis）分析。通过SDS-PAGE（见图2a）
发现5个流分中的蛋白质相对分子质量分布呈阶梯状下降，表明使用SEC可通过蛋白质相对分子质量大小进行分离，从而有效降低组织蛋白质样品的复杂度，且多次进样分离，可对低丰度蛋白质进行富集，有效提高低丰度蛋白质的含量。经过RPLC-MS 分析后，对各个流分中鉴定的蛋白质相对分子质量分布进行分析，可发现蛋白质相对分子质量分布范围与SDS-PAGE结果相似，呈阶梯状下降，且各流分中蛋白质相对分子质量的中位数亦呈梯度下降（50、818~39、963Da）（见图2b）。这说明SEC可降低蛋白质样品复杂度，多次进样收集流分可有效富集低丰度蛋白质。
2.2.2SEC-RPLC提高蛋白质及肽段鉴定效率
如何在高度复杂的宽动态范围样品中鉴定低丰度蛋白质是当今蛋白质组学的主要挑战，在这种宽动态范围下，高丰度蛋白质与低丰度蛋白质的浓度差异极大，高丰度蛋白质的酶解肽段广泛存在，导致该类肽段过度采集，最终使得低丰度蛋白质的肽段信号被掩盖或忽略
。
