2017年30卷10期 Vol. 30 No. 10
海昌海洋公园预约西岛表业学板
Southwest China Journal of Agricultural Sciences2303
文章编号：l〇〇l-4829(2017)10-2303-05D O I： 10. 16213/j. c n k i. sc ja s. 2017. 10. 024广西富硒区土壤耐硒菌株的分离及鉴定 廖青，梁潘霞，邢颖，黄太庆，刘永贤，江泽普*
(广西农业科学院农业资源与环境研究所，广西南宁530007)
摘要：【目的】从广西富硒区土壤中分离出多株耐硒菌株，为土壤硒资源开发利用提供参考。【方法】在广西主要富硒区永福、巴马、玉林寒山、桂平、藤县等地采集田间土样，利用稀释平板法并通过加硒培养对耐硒徽生物进行分离、筛选。【结果】筛选得到8 株耐硒能力较强的菌株，其在固体培养基中对硒的耐受浓度均在10 〇〇〇p g/m L以上。8株耐硒菌株中，Y L B l-33耐硒能力最强，其在含硒量为29000 p g/m L的固体培养基中仍能徽弱生长。经16S rD N A序列分析和系统发育分析，鉴定结果表明，Y LB1~6为蜡 质芽孢杆菌、B M B2-1和T X B1-8为短小芽孢杆菌、G P B2-5为苏云金芽孢杆菌、Y L B1-26和Y L B1-33为地衣芽孢杆菌、Y L B1-2和Y F B1-8为粘质沙雷氏菌。【结论】耐硒菌株的发现对广西 土壤硒资源利用、富硒农产品开发具有潜在的应用价值。
关键词：富硒土壤；耐硒；菌株；鉴定；广西
中图分类号:S153.6文献标识码：A
Isolation and Identification of Se-tolerance
Strains from Se-rich Soil in Guangxi
LIAO Q ing, LIANG Pan-xia, XING Y ing, HUANG Tai-qing, LIU Yong-xian, JIANG Ze-pu * (Agricultural Resource and Environmental Research Institu te, Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Guangxi Nanning 530007, China)
A b stra c t :【Objective 】To provide reference for Se resource exploitation of so il, many strains of Se-tolerance were isolated from Se-rich soil in
Guangxi. [M eth o d]T h e dilution spread plate method and Se-added culture method were used to screen the Se-tolerance strains from the soils which were sampled from the main Se-rich areas such as Yongfu, B am a, Yulin H an sh an, Guiping and T en g x i.【R esu lt】8 strains with high Se-tolera
nce capacity were obtained. These strains could tolerate the Se concentration above 10000 [xg/mL in solid medium. Among the 8 strain s, YLB1-33 showed the highest Se-tolerance. It could still grow weakly in the solid medium with Se concentration 29000 [xg/mL.
Based on the sequencing of 16S rDNA and phylogenetic analysis, results showed that YLB1-6 was identified as Bacillus cereus, BMB2-1 and TXB1-8 were identified as Bacillus p u m ilu s,GPB2-5 was identified as Bacillus thuringiensis,YLB1-26 and YLB1-33 were identified as Ba-似, and YLB1 -2 and YFB1 -8 were identified as Serraha marcesce?w. [ Conclusion ] The finding of Se-tolerance strains had potential application value on promoting the utilization of Se soil resources and the development of Se-rich agricultural products in Guangxi.
K ey w o rd s ： Se-rich soil ；Se-tolerance ；Strains ；Identification ；Guangxi
【研究意义】硒（Se)是人体必需的15种微量元 素之一，适度开发利用土壤硒资源，生产天然富硒农 产品，对于满足人们日常补硒的需求尤为重要。广 西是富硒大省区，富硒土壤面积达212万hm2，为目 前全国圈定出的特大面积连片富硒土壤区域[1]，土
收稿日期=2017 -06-28
基金项目：广西科学研究与技术开发计划项目（桂科合4151040 01-22)；广西科技计划项目（桂科攻1598006-5-13)；广西富硒特 作物试验站项目（桂TS201611)；广西农业科学院科技发展基 金和科研业务费项目（桂农科2015顶23，2017顶01，2017頂03)
作者简介：廖青（1981 -)，女，广西梧州人，硕士，副研究员，主要从事土壤生态和高值农业研究，E-m ail: liaaqing81@163.
com, * 为通讯作者：江泽普，E-m ail:lzj+eep@163。壤硒含量最高可达2.29mg/k g m。然而，由于广西 富硒土壤在中酸性土壤区分布较多，硒易与铁形成 溶解性极低的氧化物和水合氧化物，硒有效硒大大 降低[3]，土壤硒资源优势得不到充分地发挥。研究 如何提高土壤有效硒含量，对土壤硒资源优化利用 具有重要意义。【前人研究进展】微生物在硒的地 球化学循环和形态转化中发挥着重要的作用[4_6]，它可以通过氧化、还原、同化、甲基化等多种方式代 谢硒[7]。研究发现，许多微生物可以耐受高浓度的 亚硒酸盐，如假单胞菌sp.)、戴尔福 特菌（to r a/ia t e n i)、球形芽抱杆菌（
中，其耐亚硒酸盐的浓度高达600 m M[8]。
2304西岛表业学板30卷
高硒环境是超耐硒微生物种的潜在来源，一些学 者从湖北恩施渔塘坝筛选出多株超耐硒细菌，彭祚 全等[9]所筛选的鲍氏不动杆菌 maranii)、地衣芽抱杆菌（BaciWwj Zic/ien^irm is)和枯 草芽孢杆菌（SaciMus)，其耐硒能力高达25 000 pg/m L；袁永强等[1°]筛选到的3株具有还原 亚硒酸盐能力的细菌，其耐硒浓度高达800 m M，这 是目前细菌耐受四价硒的最高浓度之一。研究表 明，高硒胁迫下细菌会产生应激反应，将毒性高的四 价硒或六价硒转化成低毒的元素硒。因此，利用微 生物对硒的转化作用有可能实现土壤硒的生物活 化。【本研究切入点】目前，我国高硒地区如湖北恩 施州开展耐硒微生物研究起步较早，而广西关于土 壤硒转化相关微生物的研究未见相关报道。【拟解 决的关键问题】从广西富硒地区采集多个土壤样品 并进行耐硒微生物筛选，以期为后继获取天然富硒 微生物进行土壤硒活化奠定基础。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1菌种从广西永福、巴马、玉林寒山、桂平、藤县等多个富硒区采集土壤样品中分离、纯化。
1.1.2试剂亚硒酸钠（Na2Se03，A R98 %)购自 山东西亚化学工业有限公司为，磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered S aline,PBS)购自上海生工生物 工程技术服务有限公司；其他化学药品均为国内生 产的分析纯产品。
硒液制备：称取22.35 g Na2Se03，溶于去离子 水中并定容至1〇〇m L，此溶液硒浓度为100mg/ m L，使用无菌滤头（0.22p m)过滤后备用，存于避 光处。
1.1.3培养基包括细菌、放线菌、真菌的液体培 养基和固体培养基。
细菌液体培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化 钠 5 g，蒸馏水 1000 m L，PH7.3 ±0.2;
放线菌液体培养基：可溶性淀粉20g，氯化钠 0.5 g，硫酸亚铁0.01 g，硝酸钾1g，磷酸氢二钾0.5 g，硫酸镁 0.5 g，蒸馏水 1000 m L,PH7.3 ±0.2;
真菌液体培养基:20 %马铃薯浸出液1000 m L，蔗糖20g。马铃薯浸出液的制备：称取去皮马铃薯 切块200g，加蒸馏水1000m L煮沸0.5 h，用纱布过 滤取汁，补足原来的水量。
细菌、放线菌、真菌固体培养基：营养琼脂、高氏 合成I号培养基、马铃薯葡萄糖琼脂均购自广东环 凯微生物科技有限公司。
所有培养基均在121 °C灭菌20m in后使用。1.2试验方法
1.2.1微生物的分离在广西永福、巴马、玉林寒 山、桂平、藤县等多个富硒区采集土壤样品进行微生 物的分离。取10g土样加入到预先装有10颗玻璃 珠的90 m L的无菌PBS中，30 °C、200 r/m in振荡30 m in，静置5 m in，收集土壤悬液，于5000 r/m in离心 15 m in，沉淀用10 mL PBS悬浮,4 °C保存备用。取 2 m L制备好的样品加入到100m L含硒浓度为100 pg/m L的液体培养基中进行筛选培养，然后用梯度 稀释法制备1〇_2 ~ 10系列稀释液，取1〇〇M分别 涂布到固体培养基中,30 °C下培养至菌落
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长好，挑 取单个菌落，采用平板划线法获得菌株纯培养物。1.2.2耐砸能力筛选将分离纯化得到的菌株接种到液体培养基中培养，取5 p i 24 ~48 h培养液接 种不同硒浓度的固体培养基中。含硒固体培养基中 硒的浓度递增梯度为1〇〇、200、300、400、500、600、700、800、900和1000 pg/m L，经过前10轮加硒培养 基淘汰后，能存活下来的菌株再进行更高硒浓度筛 选。
1.2.3 耐砸菌株的分子生物学鉴定菌株16S rD- N A序列由南宁国拓生物科技有限公司进行测定。所得序列提交至GenBank，用B LAST软件与Gen- Rank库中 已知序列进行相似性 比对，并利用 MEGA 5.0软件构建系统进化树，确定菌株的种属类别。
2结果与分析
2.1菌株分离
本试验采用加硒液体培养基进行耐硒菌株初 筛，利用梯度稀释涂板，从多个广西富硒土壤样品中 共分离到具有不同菌落特征的微生物菌株62株，其 中细菌32株，放线菌9株，霉菌10株，酵母菌11株。采用平板划线法将这些菌株进行纯化，菌株纯 化后于试管斜面上4 °C保藏。
2.2耐砸能力筛选
经过前10轮加硒浓度递增筛选，能够在硒浓度 1000网/m L的固体培养基上存活的菌株有38株，其中
细菌26株，霉菌5株，酵母菌7株，这些菌株均 能将亚硒酸钠还原成红单质硒，在含硒平板上呈 现红菌落。所筛菌株中，放线菌对硒的耐受性最 差，其中2株对硒的耐受最高耐硒浓度也仅为900 pg/mL，当硒浓度达到1000 pg/mL所有放线菌均不 能生长;7株酵母菌虽然能耐受1000 pg/m L硒，但 生长很弱，在平板上菌落呈点状；霉菌在1000 Ag/ mL硒的平板上，生长也有不同程度的减弱，表现为 菌丝生长受抑制；细菌对硒的耐受性相对较强，所筛 细菌中,80 %能在硒浓度为1000 pg/rnL 的平板上
10期
廖青等：广西富砸区土壤耐砸菌株的分离及鉴定2305
YLB1-26 YLB1-2
YFB1-8
YLB1-33
图1
耐硒菌株菌落形态
Fig. 1
Colony morphology of strains with high Se tolerance
生长_量大多数细菌生长良好s
能耐受_l 〇〇〇 |x g /m L 福的■肅株再进行吏高耐砸 能力测定，平板硒浓度从1〇〇〇 ~ 30 000 |x g /m L ，砸 梯度按500 |x g /niL 递增。随着培养基中硒浓度逐 渐提高，菌株生长受到抑制，高于其耐受能力即不能 生长。结果表明，酵母菌最高耐受硒浓度为15〇〇 |j u g /inL ，霉菌为.3000 |x g /m L ，细■菌为 29 000 ]xg /m L * 其中，耐10 000网/m L 硒以上J 的细菌一共有8株 (图1)，其中3株耐砸浓度
为11 〇〇〇 pg /m L (分别命 名为 YLB 1"6、B M B 2-1、TXB 1-8)，1 株耐硒 11 500 |x g /ntL (GPB 2-5)，l 株耐砸 15 000 |x g /_r i i L (YLB >l - 26)，2 株耐砸 20 000 |j u g /m L (分别命名为 Y L B 1-2、
YFB 1-8)，1 株耐砸.29 000 (xg /m L ( YLB .1-33)。
2.3菌株鉴定结果
2.3.1菌落形态特征营养琼脂培养基37 t 培养 24 h 后，各菌株菌落形态如图1所示。菌株YLB14 生长良好，菌落呈灰白，圆形或近圆形，边缘呈放 射融蜡状，菌落中央稍隆起，不透明，质地软，稍有光 泽；菌株BMB2-1近似圆形，淡黄，扁平，边缘不整
齐，半透明，表面光滑、湿润；菌株T X B 1-8近圆形， 淡黄，扁平，边缘不整齐，不透明，表面湿润、光滑、
有黏性；菌株GPB 2-5菌落呈圆形，白，不透明，边 缘整齐、光滑；菌株Y L B 1-26和Y L B 1-33呈白，圓 形，白，扁平，不透明，边缘呈锯齿状，表面粗糙皱 褶；菌株Y LB 1-2和YFB 1-8菌落圆形，中间凸起，不透 明，表面光滑，边缘整齐，较粘稠，易挑起。
2.3.2 16S D N A 扩增结果挑选耐 10 000 (jug/m L 砸以上的8株细菌通过P C R 扩增出其
rD N A (图
2)，这些菌株的16S tD N A 序列长度均在1450 b p 左右。 2.3. 3 16S D N A 序列同源性及系统发育分析结果
B L A S T 分析结果(表1)表明，这
8株耐砸细菌与 其同源菌株相似性均在99 %以上,Y L B 1-6可初步 鉴定为蜡状芽孢杆菌
cma «
)，BM B 2-1和
T X B 1 -8 为短小芽抱杆菌（
通p z im ito ) GPB2-5
为苏 z S ■金芽.抱.杆菌（S c k ；通w
，Y L B l -26
和 Y L B 1-33 为地衣..菜抱.杆■菌（B oci&w Ifc /iera /or -
m is )，.Y L B 1-2 .和 YFB .1-8 为_粘质沙雷氏黃{Sen 前:a ,.
niarcescens} 〇
1500 bp 1000 bp
Mt M arker ； 1： XLBI-26； 2： TXB1-8； 3j YLB1-6； 4： BMB2-1； 5； ¥LBl-33j 6s GPB2-5； 7： YLB1-2； 8；X PBI-8
图2 16S rDNA 的PCR 扩增产物
Fig. 2 PCR amplified products of I6S
rDNA
2306西杳农此学板30卷
表1菌株16S rDNA序列同源性分析结果
T ab le 1 S eq u en c e homology an a ly sis of strain s based on 16S rD N A seq u en ce s
菌株同源菌株相似性(％)
S trains T he n e a re st type strain Identity
Y LB1-6婚质芽抱杆菌石况说似DS1699
BMB2-1短小芽孢杆菌S o d—MTCC7514100
T X B1-8短小芽抱杆菌 R H S/T-38499
G PB2-5苏金芽抱杆菌BAPE199
Y LB1-26地衣芽孢杆菌S a c边u s心CCM M B92799
Y L B1-2粘质沙雷氏菌 SY J1-999
Y FB1-8粘质沙雷氏菌 SM3999
南宁市风景区旅游景点Y LB1-33地衣芽抱杆菌 X J-P9599
图3基于16S r D N A序列的系统发育树
Fig. 3 Phylogenetic tree b ased on 16S rD N A seq u en ce s
以N-J法（MEGA 5.0软件）构建了广西富硒地 区耐硒细菌16S rDNA序列的系统发育树（图3 )。在系统发育树中，本研究所得耐硒细菌聚集为2个 大分支，一个分支为Bacillus，另一分支为Serratia。其中，为优势菌。结合菌株16S DNA序 列分析和系统发育树分析，可将YLB1-6鉴定为蜡 状芽孢杆菌，：B MB2-1和TXB1-8鉴定为短小芽孢杆 菌，GPB2-5鉴定为苏云金芽孢杆菌，YLB1-26和 YLB1-33鉴定为地衣芽孢杆菌，YLB1-2和YFB1-8 为粘质沙雷氏囷。
3讨论
本研究通过对广西富硒区耐硒菌株进行筛选，发现土壤细菌耐硒能力最强，放线菌耐硒能力最差；所筛8株耐硒菌株均为细菌，经16S rDNA序列及系 统发育综合分析，6株属于常见耐受硒的芽孢杆菌 纲（Bacill)，另外2株属于真细菌纲（Eubacteriae)，粘质沙雷氏菌具有高耐硒能力为首次报道；这些菌 株在加硒固体培养基上均能耐受硒浓度10 〇〇〇pg/ m L以上，其中YLB1-33耐硒能力最强，达29 00
0 pg/mL，这在广西富硒地区（非高硒区）极为罕见。
关于微生物耐硒机理存在多种假说。目前较为 认可的一种假说是，微生物通过自身还原作用将高浓度砸酸盐或亚砸酸盐转化为低毒的红单质硒[11_13]从而降低高硒环境对菌体的毒害作用。这 种红单质硒其实是一种易溶于水的红元素硒- 蛋白复合物[14]，因其毒性小，对热稳定，被认为是硒 生物解毒的方式[15]。耐硒微生物还原产生的红 单质硒在护肝、免疫调节、抑瘤等方面具有较好的生 物活性[16]，因而可直接用作保健补硒制剂。另一方 面，耐硒微生物在硒的代谢中可实现硒的不同价态 的转化，并且能将无机硒转化成有机硒，在土壤硒活 化方面具有巨大的应用潜力。广西富硒土壤以酸性 红壤和赤红壤居多，土壤硒以亚硒酸盐为主，易被铁 的氧化物和粘土矿物吸附，但在耐硒微生物的作用 下，强吸附态的亚硒酸盐有可能转化为可溶性有机 硒[17]，被吸附固定的硒获得释放，土壤硒的有效性 得以提尚。
耐硒微生物尽管在土壤硒活化方面有巨大的应 用潜力，但还是要对其作进一步筛选以获得有效硒 转化效率高的菌株，并开展天然富硒微生物活化条 件研究及在富硒土壤的定殖能力研究，这对广西土 壤硒资源利用、富硒农产品开发更有重要的现实意 义。
4结论
本研究从广西多个富硒区分离鉴定出8
株耐硒
廖青等：广西富硒区土壤耐硒菌株的分离及鉴定2307 10期
微生物，分别是:1株蜡质芽孢杆菌、2株短小芽孢杆 菌,2株地衣芽孢杆菌,1株苏云金芽孢杆菌,2株粘 质沙雷氏菌，说明耐硒微生物具有种多样性。耐 硒微生物的发现对土壤资源利用、富硒农产品开发 具有潜在的应用价值。
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(责任编辑汪羽宁）
