江苏预防医学 2021 年1月第32 卷第1期Jiangsu J Prev M ed，Jan.，2021，V ol.32，No. 1• 13 •
李春香1，陈国清2，王瑶2，李峰2，徐士林2，李长城2
1•盐城市妇幼保健院，江苏盐城224000;2•盐城市疾病预防控制中心
摘要：目的对盐城市1起病毒性脑炎聚集性疫情分离的Echovirus18(E-18)型肠道病毒进行V P1基因分子进化特征分 析。方法通过实时荧光RT-P C R方法，对2019年盐城市病毒性脑炎聚集性疫情标本进行肠道病毒的检测，对非EV71或 CVA16其他肠道病毒进行分子分型，采用RT-PC R扩增E-18型肠道病毒V P1基因并测序，采用生物信息软件从核苷酸、氨
基酸和分子进化3个层面进行分子特征分析。结果该起病毒性脑炎聚集性疫情是由E-18型肠道病毒感染引起，其6例病 例；肛拭子肠道病毒核酸通用阳性4例，阳性率66. 67%；均为轻症，全部治愈。4株E-18型肠道病毒株V P1基因片段均未见 核苷酸的插人或者缺失，长度均为861 bp、编码287个氨基酸，其核苷酸、氨基酸同源性分别为99. 9%〜100. 0%和100. 0%;
与2019年£-18型手足口病盐城株（151/?^]^©/』8丫(：/2019)¥?1基因核苷酸、氨基酸同源性分别为99.5%〜99.7%和100. 0%；与原型株Metcalf V P1基因核苷酸、氨基酸同源性分别为79. 0%〜79. 1%和93. 4%。遗传进化树显示,2019年盐城 市4株病毒性脑炎代表株与1株手足口病代表株聚集成簇，构成1个独立进化分支，属于C2基因亚分支毒株。与原型株 M etcalf相比，盐城市4株病毒性脑炎代表株涉及19个氨基酸位点的变异，变异率为6.62%，与1株手足口病代表株在V P1
基因&C loop区域发生了 R84N氨基酸位点的变异。结论该起病毒性脑炎聚集疫情由E-18型肠道病毒引起，该病毒属于
C2基因亚优势进化分支，与本地手足口病代表株可能有共同的来源。
关键词：病毒性脑炎；Echovims 18型肠道病毒；基因型；V P1基因；序列分析
中图分类号：R373. 2 文献标识码：A文章编号：1006-9070(2021)01-0013-04
Molecular characteristics of the VP1 gene of
Echovirusl8 in a viral encephalitis epidemic
LI Chun-xiang* ,CHEN Guo-qing,WANG Yao,LI Feng,XU Shi-lin,LI Chang-cheng
* Yum'heng M aternity and C hild Health Care H o s p ita l，Jia?igsu Yancheng m〇00,C hina Abstract：Objective To analyze the molecular evolution characteristics of the VP1 gene of Echovirusl8 (E-18) in a clustered viral encephalitis epidemic in Yancheng city. Methods The rea卜time RT-PCR method was used to conduct nucleic acid detection for samples collected in a viral encephalitis epidemic.The non EV71 or CVA16 enterovirus strains were subjected for molecular subtyping analysis. The VP1 coding regions of E-18 strains were amplified by RT-PCR followed by sequence analysis. The molecular characteristics of the VP1 regions were analyzed by bioinformation softwares at nucleic acid level, amino acid level and molecular evolution level. Results The viral encephalitis epidemic was caused by E-18 infection.The general positive rate of enterovirus nucleic acid of anal swabs of 6 cases was 66. 67% (4 cases) ,and all 6 cases were mild patients and cured.No nucleotide insertion or deletion was found in the VP1 coding regions of the 4 E-18 strains,all had 861 bp and encoded 287 amino acids.The nucleotide and amino acid homologies were 99. 9%-100. 0%and 100. 0%,respectively.Compared with 1E-18 strain (151/HFM D/JSYC/2019) isolated from a hand foot mouth disease( HFMD) patients in 2019 and prototype strain Metcalf, the nucleotide and amino acid homologies were 99. 5%-99. 7%and 100. 0%,79. 0%-79. 1%and 93. 4%,respectively.Phylogenetic analysis showed the 4 E-18 strains isolated from the viral encephalitis epidemic and 1strain from HMFD patient were clustered
上海必玩景点to form an independent evolution branch belonging to C2 subgroup. Compared with the prototype strain Metcalf, the 4 E-18 strains had mutations in 19 amino acid sites,resulting mutation rate of6. 62%.The 4 E-18 strains and 1HFMD strain all found
R84N mutation in B-C loop region. Conclusion The clustered viral encephalitis epidemic was caused by E-18 infection, which
D()I：10.13668/j.issn. 1006-9070.2021.01.004
基金项目：盐城市医学科技发展计划项目（YK2018022)
作者简介：李春香（1984—），女，江苏盐城人，助理研究员，研究方向：分子遗传学
通信作者：陈国清•副研究员，E-mail: chenmin0510@ s ina. com
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belongs to the dominant evolutionary branch of C2 gene subgroup and may share the same origin with the local HFMD representative strain.
Keywords：Viral encephalitis；Echovirus 18；genotype； VP1 gene；Sequence analysis
根据国际病毒分类委员会分类，感染人的埃可病 毒(Echovirus，EchoV)属小R N A病毒科肠道病毒属 B组病毒，目前有28个血清型[1]。Echo病毒大多为 隐性感染，引起的疾病谱较为复杂，包括手足口病、呼 吸道感染、无菌性脑膜炎、心肌炎、腹泻等多种疾病[2_4]。我国病毒性脑炎病原主要是人类肠道病毒(human enterovirus,H E V)1-5"6-1,M Echovirusl8 (E-18)病毒主要在美国、欧洲、韩国等地有局部流行报道[7_9]，近年在江苏、河北、吉林、云南、山东等地[1’81°]有局部流行；偶尔在手足口病非C V A16或E V71其 他肠道病毒分子分型监测中出现[1112]，该病毒在我国 的地理分布特点和疾病谱尚不明确。根据国际通行 将肠道病毒V P1基因核苷酸序列差异大于15. 0%作 为区分不同基因以及参考Chen等「如对E-18型肠 道病毒的分型研究，分为A、B、C 3个基因。C基因 根据聚类毒株时空进化关系分为C1、C2分支亚。
2019年6月盐城市某幼儿园报告1起病毒性脑 炎的聚集性疫情，共报告6例，其中4例病原检测结果 为肠道病毒通用阳性，E V71和C V A16型均为阴性。通过进一步的分子分型分析，判定该疫情是由E-18引起的病毒性脑炎聚集性疫情。现对检测到的该病毒 进行分子流行病学研究，掌握其来源、地理分布及遗 传特征，丰富本地E-18病毒基因库。
1材料和方法
1.1标本来源依托盐城市第三人民医院承担的中国疾控中心“严重临床异常病例/事件监测项目”，在 H I
S系统增加了严重脑炎聚集性病例预警模块系统。2019年6月18日预警系统发现同一所幼儿园同一个 班陆续有6例病毒性脑炎的临床诊断病例。参照手 足口病监测方案，6月24日采集了 6例孩童的肛拭子 标本，在低温冷藏条件下24 h内送盐城市疾病预防控 制中心进行核酸检测。
1. 2 方法
1.2.1核酸提取和实时荧光R T-P C R检测运用MagMAX™-96Viral RNA Isolation Kit 试剂盒在ABI MagMAX express24自动核酸提取仪提取病例 样本病毒R N A。采用江苏硕世生物科技有限公司生 产的肠道病毒通用单通道、E V71/C V A16型肠道病毒 双通道核酸检测试剂盒进行核酸的实时荧光RT-PCR 检测，实验体系配置、对照设置、反应程序设置、结果 判断流程严格参照试剂盒说明书要求。
1.2.2其他肠道病毒分子分型对肠道病毒通用阳性、但EV71和C V A16阴性的样本，以未分型其他肠 道病毒核酸阳性R N A为模板，进行半巢式P C R扩 增，P C R扩增试剂盒、引物序列、反应体系配置、反应 条件以及扩增产物条带的确认均参照文献[3]。将阳 性P C R扩增产物（147 bp)送上海生工生物公司进行 测序，获得标本的核苷酸序列与GenBank数据库中的 序列B L A S T比对，进行分子分型分析。
1.2.3 E-18型肠道病毒V P1基因核苷酸序列扩增
以分子分型鉴定为E-18型肠道病毒R N A为模板，采用上述参考文献试剂盒进行2轮半巢式P C R扩增，E-18型肠道病毒V P1基因引物自行设计（？1:5'- CACTGGTCRGGRAGTGTGA-3’；F2:5'-TCACAC-TA YA G RA TG G TG C-3，；R：5'-CCTGYTCCA-TYGCRTCATC-3')，理论扩增片段长度1 507bp(包 含了全长V P1基因861 bp)。体系配置、扩增程序参 考上述试剂盒说明书。P C R扩增产物进行1. 5%琼脂 糖凝胶电泳确认。经确认的扩增产物送上海生工生 物公司进行测序，将获得的序列与GenBank数据库中 的序列B L A S T比对确认。
1.2.4 E-18型肠道病毒序列分析及遗传进化树的构 建从GenBank核苷酸数据库选取国内外有代表性 的E-18型肠道病毒参考株（包括1998年美国原型株 Metcalf，A F081331;A参考株 GQ329813，B参考 株JN203850，C1参考株HG793724，C2参考株 MG720251)和2019年盐城市代表性肠道病毒毒株(151 /HFMD/JS Y C/2019)V P1基因片段序列信息，采用生物信息学软件Lasergene V7. 1软件包D N AStar中M egAlign进行V P1基因片段核苷酸和 氨基酸序列同源性分析，m afft方法进行核苷酸序列 比对，MEGA 6.0 软件以邻接法（Neighbor-Joining method)构建V P1基因亲缘关系分子进化树，可靠性 采用 1 000 次（replicates)bootstrap来评估。
2 结果
2. 1一般情况6例病例，男性4例，女性2例。首 发病例，男，6岁，6月17日发病;6月18日发病2例；6
月21日3例;6例病例均有发热、头疼、恶心、呕吐等 症状，脑电图轻度异常，经住院给予对症措施后，均痊愈出院。
2.2病例标本肠道病毒的分子分型采集6例聚集 性脑炎病例肛拭子标本，进行实时荧光R T-P C R检 测，4例肠道病毒通用阳性，阳性率为66. 67%；但 EV71和C V A16为阴性，判定为其他肠道病毒核酸阳
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性。通过分子分型引物扩增测序，经GenBank核苷酸
数据库中的序列比对，判定为E-18型肠道病毒，依次
命名为l/JSY C/2019、3/JS Y C/2019、4/JSY C/2019
和6/JSY C/2019。是本市2014年后第2次检出E-18
型病毒。
2.3病毒VP1基因核苷酸和氨基酸同源性比较4例
肠道病毒核酸阳性标本进行VP1基因片段半巢式PCR
扩增、测序，经B L A S T比对确认为E-18型VP1基因核
苷酸序列。病毒株VP1基因片段均未见核苷酸的插入
或者缺失，长度均为861 bp、编码287个氨基酸。4株病
毒株VP1基因组内核苷酸、氨基酸同源性分别为
99. 9%〜100. 0%和 100. 0%；与 2019 年 E-18 型手足口
病盐城株（151/HFMD/JSYC/2019) VP1基因核苷酸、
氨基酸同源性分别为99. 5%〜99. 7%和100. 0%；与原
型株Metcalf VP1基因核苷酸、氨基酸同輝性分别为
79. 0%〜79. 1%和93. 4%；与其他各基因型参考株之间
的VP1基因核苷酸、氨基酸序列同源性见表1。
表1盐城市4株E-18毒株与
各基因型参考株V P1区核苷酸和氨基酸同源性
基因型V P1基因
长度(bp)
核苷酸
同源性（％)
氨基酸
同源性（％)
参考株
A86177. 8〜77. 993.4GQ329813 B86181.592. 3JN203850 Cl86186. 5〜86. 696.5HG793724 C286195. 6〜95. 799. 7MG720251
2.4病毒V P1基因核苷酸序列分子进化树分析盐城4株E-18毒株与1株手足口病代表株聚集成簇，构 成1个独立进化分支，与国内2015—2016年部分省份 E-18型代表株亲缘关系相近，位于同一进化谱系，构 成C2分支亚，其是国内主流分支基因亚，远离原 型株Metcalf。见图1。
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------------------------------JN203«50_E18_N-2«i J*
注:•表示原型株Metcalf:
省人力资源和社会保障公共服务网▲表示盐城市2019年病毒性脑炎4株代表株；
♦表示盐城市2019 1例手足口病代表株
图1盐城市2019年4株E-18型肠道病毒
VP1基因核苷酸序列分子进化树
2.5病毒V P1基因编码氨基酸变异位点分析盐城
4株E-18型肠道病毒V P1基因编码氨基酸与原型株 M etcalf相比，涉及19个氨基酸位点的变异，变异率为6.62%(19/287)。2019年1株手足口病E-18盐城代 表株与4株病毒性脑炎代表株编码氨基酸一致，变异 位点一致。据〇^!!等[14]报道，E-18型肠道病毒V P1蛋白的B~C loop结构区78〜89位氨基酸位点是重要 的中和抗原表位，其位点的变异可能直接影响病毒逃 脱宿主的中和免疫，盐城病毒性脑炎4株代表株与1株手足口病代表株在84位氨基酸位点均发生了
R84N的变异。见表2。
表2 2019年盐城市4株E-18型肠道病毒V P1基因编码氨基酸变异位点分析
毒株204258758492127129174189215216221257266269271285287 1/JSYC/2019K L V L N V Q E A L F V K G V A K V R 3/JSYC/2019K L V L N V Q E A L F V K G V A K V R 4/JSYC/2019K L V L N V Q E A L F V K G V A K V R 6/JSYC/2019K L V L N V Q E A L F V K G V A K V R 151/HFM D/JSYC/2019K L V L N V Q E A L F V K G V A K V R MetcalfC AF081331)T I I I R I I D P S Y I R R I S T A H
3讨论
病毒性脑炎为非法定传染病，病原谱广泛，系引 起孩童中枢神经系统感染性疾病，目前国内尚无相
应监测体系，病原谱构成以及流行特征尚不明确。2019年盐城市H IS系统严重脑炎聚集性病例预警模块系统陆续发现6例聚集性病例，经鉴定，肠道病 毒通用核酸阳性，EV71和C A V16均为阴性，作为其 他型别肠道病毒进行分子分型分析，判定为1起由 E-18型肠道病毒引起的病毒性脑炎聚集性疫情。这 是本市继2014年发现E-18病毒引起的病毒性脑
炎
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疫情后第2次检出该型別，由于当时实验室检测技术条件受限，无法获取分子生物学信息，未进行分子 溯源，其进化、传播链不明确[15]。
目前，针对肠道病毒的研究主要集中在外壳蛋白VP1基因区域.不仅因其是主要的抗原表位区域，而且此区域的核苷酸序列分型与病毒血清型具有一 致性，是分子流行病学研究的重要靶标[16]。4株E-18型肠道病毒与参考株构建的分子进化树表明：毒 株根据聚类亲缘关系分为A、B、C 3个基因分支，目前国内外主流进化分支位于C基因，C基因 根据年代、地理分布差异分为C1和C2两基因亚 分支。其中，C1基因亚的毒株主要由流行于国外的2006—2013年，C2基因亚毒株分布范围广泛(国内、国外），流行时间较长（2004—2019年），具有 较强的传播能力，是主流进化基因亚分支毒株。盐城4株病毒性脑炎E-18型毒株与1例手足口病例 代表毒株聚集成簇，形成一独立进化小分支，与国内 2015—2016年主要代表株（江苏、山东、河北、云南、黑龙江等地)不在同一进化小分支中，可能具有不同 的传播来源，亦或是国内毒株循环进化的结果（因GenBank数据库2016—2019年缺乏E-18的数据，造成分析缺乏连续性）。聚类的5株盐城株毒株V H基因编码氨基酸一致，与原型株Metcalf相比，涉及19个氨基酸位点变异，特别值得注意的是，在 frC loop区域84位氨基酸位点均发生
了R84N变 异，可能会影响宿主对病毒的中和免疫效果，但6例 病例从临床表现及流行病学角度分析均符合病毒性 脑炎的定义，与以往病例无明显差异。E-18型肠道 病毒V P1基因编码区氨基酸位点的分析支持了盐城 病毒性脑炎与手足口病代表株的共同来源。同种型 别、同种来源的病毒引起不同的疾病表现可能与个体差异、毒株差异、毒株核苷酸位点变异引起抗原漂 移等因素有关。
综上，本文以分子流行病学的研究方法对1起由 E-18型肠道病毒引起的盐城市病毒性脑炎聚集性疫 情进行了分子溯源，表明该疫情病原与手足口病的E-18型肠道病毒有着共同来源。因E-18型病毒在我国 报道和研究较少，引起的疾病谱较为复杂，今后应加 强对监测力度，并从分子进化的角度分析E-18型病毒 引起的疾病流行规模与临床症状的关联性。参考文献
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收稿日期：2020-09-29编辑：彭海燕
