查广才;杨东娟;邹海鹰
【摘 要】通过纯化浓缩,收集低盐度养虾池水体中的拟柱胞藻(Cylindrospermopsis raciborskii),分析拟柱胞藻营养成分与元素组成,结果显示:藻体含碳42.67%、氢6.87%、氮8.80%,C/N比为4.85,粗蛋白含量为54.97%,粗脂肪含量为4.26%.藻体富含23种微量和稀有元素,其中重金属Cr、Cu、Pb、Ni和Ti的含量较高,表明拟柱胞藻具有强的富集环境重金属和耐污能力.通过改良稀释Zarrouk培养基,在温度为30(±1)℃、光照强度为20 klx、100 r/min的振荡器中震荡培养,培养周期为10d,细胞培养密度达104个/mL,培养过中藻丝形态会发生变化. 【期刊名称】《广东农业科学》
【年(卷),期】未来40天天气预报图2010(037)008
【总页数】3页(P6-8)
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【关键词】拟柱胞藻;营养组成;纯化培养
【作 者】南昌旅游十大必去景点查广才;杨东娟;邹海鹰
【作者单位】韩山师范学院生物系,广东,潮州,521041;韩山师范学院生物系,广东,潮州,521041;韩山师范学院生物系,广东,潮州,521041
【正文语种】中 文
【中图分类】Q949.22+5
拟柱胞藻(Cylindrospermopsis raciborskii)，又称拉氏拟柱胞藻，为蓝藻类原核生物，属念珠藻目念珠藻科柱胞藻属[1]。在不同的环境和生长条件下，同一种类的形态变化较大，因此，在我国拟柱胞藻有中华尖头藻和拉氏拟鱼腥藻等多个名称[2-3]。拟柱胞藻在高水温、富营养化的湖泊和水库中生长良好，频繁形成藻华[4-5]，是发现能产生毒素的最新蓝藻种类，其产生的拟柱胞藻毒素是一种细胞毒素，能导致肝脏和肾脏损害[6-8]，对DNA和RNA都有损伤，但并不是所有种类都产生毒素。由于拟柱胞藻具有较强的入侵性，加之全球气候变暖，其种分布不断由热带、亚热带向温带地区扩散[9-10]，我国的广东、山东、浙江、云南、湖北及台湾均有发现，且全球很多地区淡水饮水源地都发现有毒拟柱胞藻[11-1
徐州附近哪里好玩的景点推荐2]，引起各国科学工作者的关注与研究，而拟柱胞藻在国内的研究尚属空白，对其元素组成及人工培养国内还未见相关报道。本研究的拟柱胞藻取自珠海、中山等广东珠三角地区凡纳滨对虾 （Litopenaeus vannamei）低盐度养殖虾池，该藻在低盐度、高水温、富营养化的虾池环境中可形成高而稳定的种数量，但对对虾的养殖表现为有益而不是有害[13]。为确定拟柱胞藻的生物学特性，本研究对拟柱胞藻的营养成分及元素组成进行了定量和定性分析，并实现该藻在实验室条件下的人工纯化培养，可为我国的环境保护、水产养殖及拟柱胞藻开发利用提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
拟柱胞藻分析测试样品，于2005年4月取自广东中山市横栏镇凡纳滨对虾低盐度养殖虾池，水样取回实验室静置过夜，利用拟柱胞藻在静置水体中漂浮并聚集于水面形成水华的特性，收集漂浮聚集在水面上的高纯度拟柱胞藻，再通过8 000 r/min离心分离收集样品，冻干保存。
1.2 试验方法
1.2.1 拟柱胞藻碳、氢、氮含量测定 称取1.962 mg拟柱胞藻冻干样品，采用德国Elementar Vario EL元素分析仪测定C、H、N的含量。
1.2.2 粗脂肪含量测定 称取0.2 g拟柱胞藻冻干样品，加入10 mL正己烷萃取，取正己烷萃取液，蒸干溶剂，称重。
1.2.3 拟柱胞藻元素组成分析 称取0.4 g拟柱胞藻冻干样品，加高浓度的HNO3、HClO4消化，溶液加热温度高于100℃，用水稀释定容后发现有少量不溶物，过滤后取清液，根据JY/T 015-1996（国家教委“感耦等离子体原子发射光谱方法通则”），用全谱直读等离子体原子发射光谱仪IRIS Advantage（HR）（美国 Thermo Jarrell Ash Corporation）对其元素含量进行定性分析。
1.2.4 拟柱胞藻的培养 （1）培养基配制。拟柱胞藻培养基的配制，首先配制Zarrouk培养基原液[14]和微量元素混合液（BaCl2·H2O 0.07 g，Pb(NO3)20.099 g，Na3AsO40.018 g，Sr(NO3)20.063 g，La(NO3)3·6H2O 0.04 g，SnCl4·5H2O 0.025 g，蒸馏水定容至1 L），取微量元素混合液1 mL，加入Zarrouk培养基原液，用蒸馏水定容至1 L完成改良Zarrouk培养基的配制，将改良Zarrouk培养基稀释10倍，用150 mL三角锥形瓶分装20 mL，
高温灭菌后即可用于拟柱胞藻的培养。（2）分离纯化。通过反复对比试验，得到拟柱胞藻的有效分离纯化方法：取少量样品用培养基稀释，最后用毛细管在显微镜下挑取单个目标藻，并在载玻片上漂洗3～4次，洗去其他杂藻，最后挑取单个拟柱胞藻进行接种培养。（3）培养方法。拟柱胞藻实验室培养条件：培养温度控制在30（±1）℃，光照强度20 kLx，光源为白炽灯，连续不间断光照；将接种后的培养瓶置于恒温振荡器中震荡培养（100 r/min）。（4）拟柱胞藻的生长。取对数生长期的拟柱胞藻纯培养液1 mL（2.0×104个/mL）接种到新鲜培养液(每瓶20 mL)中培养,每批接种5瓶，共培养3批。每天定时取样,每个培养瓶重复计数3次，用20 cm×20 mm浮游生物计数框计数,每次取0.1 mL培养液置于计数框，每个计数框在10×40倍显微镜下计数100个视野，还原为每毫升藻丝数量，连续观察计数3个生长周期。
2 结果与分析
2.1 拟柱胞藻营养成分
通过 Elementar Vario EL 和 IRIS Advantage（HR）元素分析仪检测分析，拟柱胞藻C、H、N 3种主要元素的含量为：C 42.67%，H 6.87%，N 8.80%，C/N 为 4.85，根据 N含量
推测粗蛋白质含量为54.97%（N含量×6.25），粗脂肪含量的测定结果为4.26%，说明拟柱胞藻为一种高蛋白藻类，其粗蛋白和脂肪的含量接近人工培养的钝顶螺旋藻[14]。
2.2 拟柱胞藻元素组成
表1为拟柱胞藻除C、H、N 3种主要元素以外不同含量范围的元素组成，常量元素共8种，其中Al元素在其他蓝藻体内的含量并不高，在拟柱胞藻体内检测出较高含量，可能是该藻对环境中大量Al2+的富集作用所致，因为在拟柱胞藻的培养基中并不需要Al元素。在拟柱胞藻体内微量和稀有元素多达 23 种， 其中 Ba、Cr、Cu、Mn、Ni、Pb、Sr、Ti、Zn 等9种微量元素上升为次常量元素，含量显著偏高， 藻体内还富含 As、Ce、Co、La、Li、Mo、Nd、Sc、Sn、V、Y、Zr等 12种微量元素。由拟柱胞藻的元素组成可知，该藻的生长需要大量微量元素和稀有元素，同时对一些常见有害元素Cr、Cu、Pb、As等具有明显的富集作用和较强的耐受能力。
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表1 拟柱胞藻元素组成含量范围1×103～1×105μg/g 30～1×103μg/g 1～30μg/g元 素Al、Ca、Fe、K、Mg、Na、P、S Ba、Cr、Cu、Mn、Ni、Pb、Sr、Ti、Zn As、B、Ce、Co、La、Li、Mo、Nd、Sc、Si、Sn、V、Y、Zr
2.3 拟柱胞藻纯化培养
拟柱胞藻目前较为有效的分离纯化方法是用毛细管在显微镜下挑取单个目标藻，并通过逐级稀释和转移，最后接种单个目标藻到培养瓶中培养。
拟柱胞藻的培养需要较低的盐度和丰富的微量元素，培养基是经过改良的Zarrouk培养基。Zarrouk培养基用于螺旋藻培养，盐度高，拟柱胞藻适宜的生长盐度在0.5‰～2‰，必须经过稀释才能培养，但直接稀释的Zarrouk培养基也培养不出拟柱胞藻，通过上述试验结果与Zarrouk培养基成分对比分析，拟柱胞藻比螺旋藻需要更多种微量元素，根据拟柱胞藻体内元素组成，筛选组合出不同于Zarrouk培养基的微量元素混合液，加入Zarrouk培养基中，稀释10倍灭菌，可用于拟柱胞藻的培养，效果良好。
拟柱胞藻生长需要较高的温度、光强，同时需要不断地搅动。拟柱胞藻的适宜生长温度为30℃左右，光照强度在20 kLx，连续与间断光照均可，与钝顶螺旋藻培养条件类似；拟柱胞藻的培养需要不断搅动或震荡，静置状态还培养不出拟柱胞藻，搅动的主要作用是促进藻殖体的断裂增殖。
实验室纯培养的拟柱胞藻，拟柱胞藻的藻丝形态变化较大，有线型和螺旋卷曲两种主要形态，在广东珠江三角洲地区的低盐度虾池中以螺旋卷曲型为主，因此，本试验的拟柱胞藻为螺旋卷曲型，但在培养过程中，有部分螺旋卷曲型转变为线型藻丝。
2.4 拟柱胞藻生长规律
拟柱胞藻在适宜的实验室培养条件下，生长周期为10 d，从接种时藻体数量1.0×103cells/mL到最大密度（3.3×104cells/mL）只需要1周时间，第8 d藻体数量开始减少，第9 d大部分藻体已解体，培养藻液由蓝绿转变为黄褐，藻丝也由紧密规则的螺旋转变为疏松不规则螺旋，呈现明显的老化。拟柱胞藻在适宜条件下种增长快，有一个明显的指数增长过程，但当种数量达到最大后，个体死亡分解呈直线下降，种的崩溃和消亡发生在很短的时间内。拟柱胞藻的个体增长与虾池中所观察到的种增长规律一致，从虾池中发现拟柱胞藻到形成高优势度的优势种，一般也只需要1周左右的时间，种增长快，不同的是在虾池中拟柱胞藻一旦形成优势种，其种比较稳定[13]。金山城市沙滩电话
3 结论与讨论
拟柱胞藻近几年爆发于广东珠三角地区低盐度养殖对虾中后期富营养化水体中。通过对虾池中拟柱胞藻的样品进行分析，发现拟柱胞藻的蛋白质和脂肪等主要营养成分与人工大量生产的钝顶螺旋藻比较接近，但微量和稀有元素的种类多，重金属含量高；因为拟柱胞藻的个体小、生物量少以及人工培养拟柱胞藻的规模小，目前还没有人工培养拟柱胞藻营养成分的分析结果，人工培养的拟柱胞藻和虾池中的拟柱胞藻在营养成分及元素组成上存在何种差别，有还待进一步研究。
在钝顶螺旋藻的培养基中加7种不同的微量元素，降低盐度即可实现拟柱胞藻的培养，尽管拟柱胞藻的培养需要大量的微量和稀有元素，但取自低盐度虾池的拟柱胞藻体的元素组成与培养基中的元素组成存在很大的差别，虾池环境中拟柱胞藻体的重金属种类和含量显著高于培养基，稀有元素的种类也明显曾多，说明拟柱胞藻对虾池中的重金属和微量元素具有明显的富集作用和较强的耐受力。因此，拟柱胞藻的元素组成与其生长环境有密切关系，拟柱胞藻可替代钝顶螺旋藻或其他藻类生物用于废水处理和重金属回收系统[14]。此外，大量的调查发现，凡是以拟柱胞藻为优势种的虾池，对虾均生长健康良好，对低盐度对虾健康养殖有重要作用，相反，以有毒微囊藻为优势种的低盐度虾池，对虾均发病死亡[13]，表明广东珠三角地区虾池中的拟柱胞藻没有产生蓝藻毒素，不同于其他环境中的种
类[15]，但对其他陆生哺乳动物是否产生毒害，还有待进一步观察。拟柱胞藻作为高蛋白低藻类，能否用于大规模生产，人工培养的拟柱胞藻营养组成是否对人和动物有益，也值得进一步研究。
