•论箸・柏树花粉主要致敏蛋白Cup a1的分离纯化 陈晴，岳诗雨，张晓楠，何韶衡
作者单位：110034沈阳，沈阳医学院转化医学研究中心，沈阳医学院药学院，
通信作者：陈晴，E-mail:*********************
DOI：10.3969/j.issn.1673-8705.2021.01.002
【摘要】目的提取和分离纯化柏树花粉主要致敏蛋白Cupal。方法使用40mmol/L
NH4HCO3缓冲液作为提取液对柏树花粉致敏蛋白进行粗提取，利用离子交换层析初步纯化其主要致 敏蛋白Cup a1，收集400mmo^L NH4HCO3组分的洗脱液，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电
泳(SDS-PAGE)对收集的组分进行鉴定。结果柏树花粉有20余条蛋白区带，通过离子交换层析纯
化出相对分子质量43000的蛋白组，主要集中在皿峰。结论初步分离纯化及鉴定了柏树花粉主要致
敏蛋白Cup a1，为临床过敏原致病机制的诊断和奠定了基础。
【关键词】柏树花粉；Cup a1；离子交换层析
基金项目：国家自然科学基金(21804093)；辽宁省博士科研启动基金(2020-BS-266)；辽宁省
自然科学基金(20180550052)；沈阳医学院博士科研启动基金(20186068)
Isolation and purification of major allergen Cup a1of Cypress pollen CHEN Qing，YUE
Shi-yu，ZHANG Xiao-nan，HE Shao-heng
Institute of Translational Medicine，Department of Pharmacy，Shenyang Medical College，Key Laboratory of Re
search on Pathogenesis of Allergen Provoked Allergic Disease of Liaoning Province，Shenyang110034,China
Corresponding author：CHEN Qing，E-mail:chenqing.0906@163
[Abstract]Objective To extract，isolate，and purify major allergen Cup a1of Cypress pollen.Methods
The allergenic proteins of Cypress pollen were extracted by using40mmol/L NH4HCO3buffer solution as crude
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extract buffer.Ion-exchange chromatography was used for purification of major allergen Cup a1.The eluate of
400mmoL/L NH4HCO3was collected.The purified proteins were identified by sodium dodecyl sulfate polyacr^^l-
amide gel electrophoresis(SDS-PAGE).Results20protein bands were separated from extract of Cypress pol
len by using SDS-PAGE.The43000protein were eluted in peak皿of ion exchange chromatography.Conclu
sion Cup a1，the major allergen of Cypress pollen was isolated and purified，providing basis for diagnosis and
treatment of allergic diseases.
[Key words]Cypress pollen；Cup a1；ion exchange chromatography
Fund program:Natural Science Foundation of China(21804093)；PhD Start-up Foundation of Liaoning
Province(2020-BS-266)；Natural Science Foundation of Liaoning Province(20180550052)；Science and
Technology Foundation for the Shenyang Medical College(20186068)
过敏性疾病被世界卫生组织列为21世纪重点防治的三大疾病之一，是当前世界性的卫生学问题[l]o柏树花粉(Cypress pollen)是引起季节性过敏性疾病最常见的原因之一，国内外对柏树花粉致敏蛋白组分的相关研究报道结果不尽相同[2]o为了减少在主要过敏原水平上引入任何可能的人工制品的风险，开发快速的提取方法，得到主要的过敏原富集物是研究的关键，可对当地过敏性性疾病进行诊断和。本研究使用40mmol/L NH4HCO3缓冲液作为提取液对柏树花粉致敏蛋白进行粗提取，利用离子交换层析初步纯化其主要致敏蛋白Cup a1，使用离子交换谱
和SDS-PAGE等方法对辽宁省锦州地区柏树花粉致敏蛋白组分进行分离、鉴定，为本地区花粉过敏的诊断及提供资料。
1材料与方法
1.1材料来源
花粉原料为中国柏树（Cypress）花粉，2017年4月柏树花粉季内于辽宁省锦州市锦州医科大学采集，采集后于-80T冷冻保存。
1.2主要仪器与试剂
Mini-PROTEAN Tetra小型垂直电泳槽（BioRad，美国）；AKTA Pure蛋白分离纯化仪（GE，美国）；Azure C300化学发光成像系统（Azure，美国）；Microl7R台式冷冻离心机（Thermo，美国）；Cascada皿全新智能纯水/超纯水一体化系统（Pall，美国）；甘氨酸、四甲基乙二胺（TEMED）、过硫酸铵（APS）、丙烯酰胺、N，N-亚甲基二丙烯酰胺、考马斯亮蓝R-250、KH2PO4、NH4HCO3和十二烷基硫酸钠（SDS）（国药集团，上海，中国）；蛋白相对分子质量标准（Takara生物技术有限公司，大连，中国）。
1.3柏树花粉粗提液提取
称量柏树花粉1.00g，用20mL410mmol/L KH2PO4快速清洗，5000X g离心除去上清液，将花粉沉淀转移至陶瓷研钵，加入液氮快速研磨，加入20mL40mmol/L NH4HCO3缓冲液将花粉转移至50mL烧杯中，4X下搅拌过夜，在4X下，20000X g离心花粉混悬液30min，保留上清，用
0.45jim滤器过滤上清，4X保存［2］。
1.4柏树花粉致敏蛋白Cup a1分离纯化
结合液A：40mmol/L NH4HCO3，洗脱液B：1000mmol/L NH4HCO3o首先用20%乙醇清洗系统泵，然后将离子交换层析柱HiTrap Q HP（1mL，GE Healthcare）柱子连接到AKTA pure仪器上，再用结合液A清洗样品泵。然后用5个柱体积A平衡柱子。通过样品泵上样，使用20%B冲洗3个柱体积，洗去未结合的蛋白质，逐渐增加洗脱液B 浓度40%，冲洗3个柱体积，同时收集洗脱液，最后增加洗脱液B浓度80%。
1.5纯化后柏树花粉致敏蛋白Cup a1鉴定
采用SDS-PAGE体系对各组分蛋白进行分析鉴定。12%分离胶和5%浓缩胶对柏树花粉粗提液和经离子交换层析分离后每一份蛋白组分进行电泳分离，电泳凝胶用考马斯亮蓝R-250染液进行染，脱和用凝胶电泳成像系统分析并进行图像采集，与蛋白质标准比对后确定蛋白质的相对分子质量。武夷山风景区旅游攻略
2结果韩国济州岛旅游景点
2.1柏树花粉粗提液的SDS-PAGE
柏树花粉粗提液中主要有20余条蛋白区带，主带有6条，相对分子质量分别为70000、45000、43000、36000、24000、17000，其中43000为柏树花粉中的主要过敏原蛋白质。在25000~100000和10000~17000区带内的蛋白含量相对丰富（图1）。
2.2Cup a1的分离纯化
上海十大奢华酒店排名2. 2.1柏树花粉粗提液的离子交换层析
阳离子交换层析结果见图2，其中皿为含目的蛋白Cup a1的收集峰。
M
44200
14300
200000
116000
97200
66400
29000
20100
图1柏树花粉粗提液中主要蛋白质分布
Fig1SDS-PAGE of major proteins in crude extract of Cypress pollen Mr：相对分子质量；M：蛋白marker；1:40mmol/L
NH4IICO3缓冲液作为提取液
2. 2.2SDS-PAGE鉴定
选择图2中标注的5个收集液进行SDS-PAGE 分析（图3），其中Lane3对应的皿收集液SDS-PAGE可见明显相对分子质量为43000蛋白条带，即目的蛋白Cup a1o
3讨论
花粉过敏（pollen allergy）又称枯草热（polli-nosis），是致敏花粉所引起的鼻黏膜炎症、过敏性哮喘
和过敏性结膜炎等症状［3-4］。
(nvulwo-dlosqe
<
5
图2阳离子交换层析谱结果
Fig2Result of cation exchange column chromatography
图3阳离子交换层析SDS-PAGE结果昆明周边好玩的地方
Fig3SDS-PAGE results of cation exchange column chromatography Mr：相对分子质量；1~5分别对应1~V号收集液的蛋
白条带
柏科植物(Cupressaceae)在国内外分布都极为广泛，1945年最早报道人类对柏树花粉过敏，在北美和澳大利亚，它们是造成呼吸道过敏非常重要的原因柏科花粉过敏症的临床数据和流行病学数据因物种
和地区而有所不同。在不同种类的柏科植物系家族中，地中海柏木亚科类植物占很大一部分，并且已经被确认为是冬季过敏症与日俱增的“元凶”[6]。在日本主要的花粉过敏源是日本雪松(日本柳杉)(Japanese cedar)⑸。在中国，柏树花粉是北部沿海地区春季主要致敏花粉[7]o据报道，3月份北京协和医院的花粉过敏患者中，60%由柏树花粉引发，圆柏(Chinese juniper)是目前北京地区3~4月上旬造成过敏性鼻炎和结膜炎最主要的原因冈。冬季周期性频发的鼻炎对抗生素疗法无响应证明了临床现象也很大程度上表现为柏树过敏症⑼o
柏树花粉中主要的致敏成分是蛋白质，对柏树花粉过敏性提取物的表征表明，该花粉至少含有6种对IgE反应的成分，主要为相对分子质量43000的糖蛋白(Cup a与高碳水化合物含量相比，这些提取物中的蛋白质含量非常低。因此，碳水化合物部分在花粉提取物中的作用是一个重要的问题，糖基可参与人IgE的结合，可能是提取物之间广泛交叉反应的原因[ll-l2]o柏树花粉提取物目前被应用于柏科花粉病的诊断和免疫疗法，然而，商业化用于体外检测的试剂盒常常对有症状的患者提供不明确或假阴性的结果，因此有必要对柏树花粉的主要过敏原进行分离纯化，以实现对花粉过敏患者特异性的诊断与[12-13]o
本研究通过对柏树花粉粗提液中主要致敏蛋白Cup a1分离纯化，使用40mmol/L NH4HCO3缓冲液作为提取液对柏树花粉致敏蛋白进行粗提取，利用离子交换层析初步纯化。结果表明，使用40mmol/L NH4HCO3进行提取时，粗提液中Cup a1含量最高(相对分子质量43000)，而其他蛋白含量较少，通过
利用酸性缓冲溶液10mmol/L KH2PO4(pH4.3)溶液对花粉进行快速清洗，溶解花粉中的碳水化合物，再利用碱性缓冲液40mmol/L NH4HCO3(pH&0)作为提取液进行提取过程，免除了脱盐、透析和冷冻干燥等繁琐过程，避免了蛋白质的降解，其碱性低盐的成分可以提取少量的蛋白质，其中过敏原蛋白为提取液的主要蛋白成分。阳离子交换层析结果，主要致敏原蛋白Cup a1主要分布在皿峰，经SDS-PAGE分析，与国内外报道的Cup a1相对分子质量43000[2]相一致。纯化后的Cup a1具有应用于制备过敏原皮试液或脱敏制剂和提高柏树花粉皮试阳性率及脱敏疗效的潜在价值，还有望开发成体外检测试剂，为临床柏树花粉变态反应的诊断和奠定基础。本研究利用离子交换层析对柏树花粉粗提液进行分离，成功纯化出柏树花粉主要致敏蛋白Cup a1o
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(收稿日期：2020-08-15)
