第46卷第2期2221年2月
贵州医科大学学报
Vol. 46 No. 2
JOURNAL OF GUIZHOU MEDICAL UNIVERSITY
2221.4
王彬宇…，黄家宇，杜秋莹，陈思忆，鲁婷婷，李莉***
基金项目］贵州省中药现代化科技产业研究开发专项项目［黔科合中药字(2012)5034］；贵州省大学生创新创业项目(20195200899) * * *贵州医科大学2018级硕士研究生* * *通信作者 E-mail ：1027072775@qq. com
(贵州医科大学药学院，贵州贵阳550225-
［摘要］目的建立赤胫散指纹图谱的定性分析和没食子酸、糅花酸及3,3，-二甲基糅花酸成分定量分析的
测定方法。方法选取本省野生赤胫散药材9批次，采用高效液相谱法(HPLC )建立赤胫散指纹图谱，采用 相似度分析、聚类分析、主成分分析及正交偏最小二乘判别分析进行质量评价，并测定8种化学成分含量。结
果 建立了赤胫散的HPLC 指纹图谱共有模式，确定了 17个共有峰,7批次赤胫散的指纹图谱相似度为0. 767
~0. 997，可分为2类；没食子酸、糅花酸及3,3，-二甲基糅花酸的含量，分别在1. 23 ~ 39. 20 m/L (-=0. 999 8)、
7. 98 ~255. 30 ma/L (-=0. 999 8)及0. 90 ~2& 80 ma/L (-=0. 999 9)的进样浓度范围内线性关系良好，加样回收
率为96.90% ~13.48%，相对标准偏差(RSD ) <3%。结论 建立的赤胫散指纹图谱和含量测定方法准确可 靠，可用于赤胫散的质量控制。
［关键词］谱法，高压液相；质量控制；赤胫散；指纹图谱；化学模式识别；含量测定
［中图分类号］R284； R917 ［文献标识码］A ［文章编号］2096-8388(202))020165 07
DOI ： 10.19367/j. cnkb 9076-C383.942).92.905
EstablisUmept of fiiigerprint 冷卩。。］ of Polygonum runcinatum
and determination of itt ttrec chemicat components
WANG Binyp , HUANG Jiayp , DU Qiuyiny , CHEN Siyi , LU Tinytiny , LI Li
(School cf Pharmacy , Guizhou Medical University , Guiyaag 550025, Guizhou , China -
［Abstrcct ］ Objective To nmO/sP the qualitative analysis d the fingem/nt spectmm d Pobygonm
runcinatum (P. runcinatum - and the quantitative analysis of gallic acid , Ulapic acid and 8,8 n diuethy/llapic acid. MetOodt Seventeen batches of wi/ P. runcinatum f/m GuizOon p/vince were
selected . Higli pePonnance liquid ch/mgoomphy ( HPLC - was used to estadlisP the fingem/nt of P. runcinatum. Simila/ty analysis , cluster analysis , p/ncipat component analysis (P
CA) and orthoxonat paPiat least spuaros disc/minant analysis were used to assess the quOPy. Three chemicat components
of P. runcinatum were detepnined. Results The HPLC fUgemUnt of the P. utncinatum was estadlisPed.Nineteen iUedtified peaks were common. The ynyem/d- siuila/Pos in 17 batches of P. runcinatum was ranged f/m 0. 768 〜0. 997. Cluster analysis sUowed that 17 batches belonyed two clusters.
Within the range of injection concedtratiod , the concedtrations of gallic acid , ellagic acid and 8 , n diuethyt ellagic acid were 1.28 〜39. 22 m/L (-二 0. 999 8) , 7. 99 〜255. 38 m/L (-二 0. 999 8 -
and 0. 90 〜28. 8 ma/L (-二 0. 999 9 - , respective/, sPowing a eood linear rela/onsPip. The
receve/ rate d injection is 96. 99% 〜198. 45% with the relative standarp deviation (RSD) < 8%.
ConCsion The estad/sPed fUaem/nt spectmm rd composibon detennination of P. runcinatum are accnrato and reliadlo , and can bo used fdr quality cont/1 of P. runcinatum.
［Key wordt ］ ch/mgoomphy , higU pressure liquid ; quality cont/1; Polygonum runcinatum ；
engem/nt ; chemical pattem mcognition ; cooteat determination
165
贵州医科大学学报44卷
赤胫散又名花蝴蝶、散血草，为蓼科蓼属植物赤胫散（Polygomm runcinatmn Buch.-Ham.var. "0^Hemsi）的干燥根茎，是西南少数民族地区民间常用药［「2］，其性寒，味苦、涩，用于跌扑损伤、痈疖肿毒及风湿痹痛等，具有清热解毒、活血舒筋等功效［7-7］o赤胫散现收载于《贵州省中药材、民族药材质量标准）2203年版中，其鉴别方法为与对照药材薄层谱法（thin layoo cOromamyra-pPy,TLC）定性鉴别，无含量测定项［6］o目前，国内外对赤胫散的质量研究较少，难以全面评价药材质量e6］o赤胫散主要含有酚酸、挥发油类成分［10-14］，其中没食子酸具有抗炎抗氧化的药理作用［5］；鞣花酸和3,3'-二甲基鞣花酸具有抗菌抗病毒活性［14-15］，毒副作用小，与赤胫散功能主治一致。基于此，本实验通过建立赤胫散高效液相谱法（hig/peOormance liquid cOnmCoanpPy,HPLC）指纹图谱，并结合化学计量学手段［15-22］进行聚类分析、主成分分析及正交偏最小二乘判别分析，同时对没食子酸、鞣花酸及3,3'-二甲基鞣花酸的含量进行测定，为其质量控制提供实验依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.3药材来源赤胫散药材17批均为本省野生（表1），经贵州医科大学药学院生药学教研室龙庆德副教授鉴定为蓼科蓼属植物赤胫散的干燥根茎。
表117批赤胫散样品来源信息
TaCc1Sonrce info/nation of17batcOes of P.-uncinatum
编号产地采收期编号产地采收期S1贵州省凯里市黄平县2417.04S10贵州省黔南州瓮安县2419.11 S2贵州省遵义市播州区2419.08S11贵州省毕节市织金县2417.14 S3贵州省安顺市关岭县2419.09S12贵州省毕节市黔西县2417.07 S4贵州省清镇市麦格乡2419.09
S13贵州省毕节市织金县2413.14 S5贵州省贵阳市乌当区2417.11
贵州省毕节市大方县
S6贵州省贵阳市开阳县2413.14
S142419.08 S7贵州省贵阳市花溪区2413.11S15贵州省黔东南州麻江县2417.04 S8贵州省贵阳市修文县2419.09S16贵州省黔东南州台江县2417.07 S9贵州省黔南州龙里县2419.08S17贵州省黔东南州雷山县2417.07
1.1.2主要试剂与仪器没食子酸对照品（批号110531-271224，中国食品药品检定研究院），鞣花酸对照品（批号GZDD-0277，纯度M98%，贵州迪大科技有限责任公司），3,3'-二甲基鞣花酸（批号107510，北京北纳创联生物技术研究院），水为纯净水，磷酸为分析纯，乙腈为谱纯，其余试剂均为分析纯;ULtiMate3000型高效液相谱仪［赛默飞世尔科技（中国）有限公司］,MS107DU型电子分析天平（瑞士Mettler-PoDdo公司），KQ3200E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。陈龙任杭州市委书记
1.2方法
1.2.1谱条件谱柱为ACE C1-XR（250mm x 4.6m叫5pm），检测波长为254n叫流速为1mL/min，柱温为34C，进样量为10pL；流动相为乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B）；梯度洗脱为0~ 6mid、5%~15%A,6~22min、15%~17%A,22〜47min、17%~36%A,45~66mm、36%~77%A o 1.2.2对照品溶液的制备分别取没食子酸、鞣106花酸及3,3'-二甲基鞣花酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成浓度为112、1.3及0.99/L的单一对照品储备液；分别精密量取上述对照品储备液适量，加甲醇稀释制成混合对照品溶液（每升含没食子酸39.22m/、鞣花酸255.34m/及3,3'-二甲基鞣花酸2880m/）o
1.2.3供试品溶液的制备取赤胫散药材粗粉（过66目筛）约0.3/，精密称定，置100mL具塞锥形瓶中，精密加77%甲醇27mL，密塞，称定质量, 37C超声（功率190W，频率40kHz）处理47mO，放冷,77%甲醇补足减失质量，经0.22pm有机微孔滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液。
1.2.2指纹图谱的建立（1）精密度试验：取赤胫散药材粉末（编号S4），按“1.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“1.2.1”项下谱条件连续进样测定2次，以鞣花酸的保留时间和峰面积为参考，计算各共有峰相对标准偏差（Oative sandarO deviation,RSD）值。（2）重复性试验：取赤胫散药材粉
9期王彬宇等赤胫散指纹图谱的建立及其3种化学成分含量的测定
末（编号S9），按“1.2.3”项下方法平行制备供试品溶液2份，按“7.2.7”项下谱条件进行进样测定，以鞣花酸的保留时间和峰面积为参考，计算各共有峰RSD值。（3）稳定性试验：取赤胫散药材粉末（编号S9），按““.2.3”项下方法制备供试品溶液，室温下放置，于2、2、4、8、12及26h时按“7.2.7”项下谱条件进行进样测定，以鞣花酸的保留时间和峰面积为参考，计算各共有峰RSD值。（4）赤胫散指纹图谱的建立：分别取77批赤胫散药材粉末，按“•2.3”项下方法制备供试品溶液，按“7.2.7”项下谱条件进行进样测定，采用中药谱指纹图谱相似度评价系统（2212年版）软件，将S7样品谱图设为参照图谱，中位数法，时间窗宽度2.2min，生成对照图谱，进行指纹图谱的建立、共有峰的指认与相似度分析。
1.2.2含量测定（1）线性关系考察：取“7.2.2”项下混合对照品溶液适量，加甲醇逐级稀释，制成系列浓度混合对照品溶液，按“7.2.7”项下谱条件进样测定，以各成分的质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制线性标准曲线，得到3种成分各自线性范围及相关系数4）。（2）精密度试验：取赤胫散药材粉末（编号SS），按“1.2.3”项下方法制备供试品溶液，以“7.2.7”项下谱条件进样测定2次，记录峰面积，计算3种成分RSD值。（3）重复性试验：取赤胫散药材粉末（编号S9），按“7.2.3”项下方法平行制备供试品溶液2份，以“7.2.7”项下谱条件进样测定，记录峰面积，计算3种成分RSD值。（4）稳定性试验：取赤胫散药材粉末（编号SS），按“7.2.3”项下方法制备供试品溶液，室温下放置，于7、2、4、8、12、24h时以“7.2.7”项下谱条件进行进样测定，记录峰面积，计算3种成分RSD值。（5）加样回收率试验：精密称取已知含量的同一批赤胫散药材粉末（编号SS）/17/，共6份，分别置于166mL具塞锥形瓶瓶中，加入各单一对照储备液适量，按2.3”项下方法制备供试品溶液，按“7.2.7”项下谱条件进行进样测定，记录峰面积，并计算3种成分的加样回收率及其RSD值。
1.3统计学分析
应用SPSS23.2软件，采用组间联接法、选择欧式平方距离为度量，对77批赤胫散共有峰峰面积数据进行聚类分析；应用SIMCA16.7软件对77批赤胫散样品共有峰峰面积进行主成分分析，绘制主成分分析得分图（以特征值>”作为标准，计算其累积方差贡献率与特征值），同时进行正交偏最小二乘判别分析，得到得分图［以变量重要性投影值（very imyo/aut person,VIS）值>7作为标准，得到可能引起
赤胫散样品间质量差异的主要标志性成分］。
2结果
2.1赤胫散药材指纹图谱的建立和方法学考察2.1.1指纹图谱方法学精密度试验中，测得各共有峰的相对保留时间RSD<2.26%，相对峰面积RSD<2.55%，说明仪器精密度良好。重复性试验中，测得各共有峰的相对保留时间RSD<2.7%，相对峰面积RSD<2.67%，说明方法重复性良好。稳定性试验中，测得各共有峰的相对保留时间RSD<2.23%，相对峰面积RSD<2.92%，表明样品在室温放置24h内稳定性良好。
2.1.2赤胫散药材指纹图谱的建立和共有峰的指认经多点校正后进行谱峰重叠匹配，标定了78个共有峰（图7）o将样品对照指纹图谱与对照品的保留时间和紫外吸收光谱比对，指认了3种成分，分别为2号峰（没食子酸）、17号峰（鞣花酸）、19号峰（3,3，-二甲基鞣花酸），其中7号峰（鞣花酸）为所有样品中均含有，分离度较好，保留时间适中且峰面积最大，因此选其作为参照峰（S，图2）o对77批赤胫散样品进行相似度计算，结果77批样品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度为2.569-2.267（表2），表明各产地样品间整体质量存在一定的差异。
2.2化学模式识别分析
2.2.1聚类分析当距离为7时，可将77批样品聚为2类，其中I类包括S7~S6、S8、S9、S7及S77,n类包括S7、S12~S14及S16。见图3。
2.2.2主成分分析主成分分析结果显示，以特征值>7作为标准时，得到5个主成分，其累积方差贡献率为56.427%；可将77批赤胫散样品分为2类，其结果与聚类分析一致，S7~S6、S8、S9、S15及S77大多集中于一、四象限,S7、S12~S14及S12集中于二、三象限。见表3和图6o
2.2.2正交偏最小二乘判别分析正交偏最小二乘判别分析结果表明,77批样品可分为9类，结果与聚类分析、主成分分析一致；模型参数Rx （c/m）=2.832,R2y（cum）=2.750，均>2.5，说明模型稳定且预测性好；绘制VIP图，以VIL>7作为标准，谱峰9、8、14、4、5、^、5、7、12及17为引起赤胫散样品间质量差异的主要标志性成分。见图5和图2o
127
贵州医科大学学报44卷
11
0102030405060
时间/min
注：〜1为共有峰编号。
图1赤胫散样品（17批）HPLC指纹图谱叠加图（S1〜S17）及对照图谱（R）
Fi/.1HPLC01X0011（S1〜S19）and controi01X001（R）of t7batcOos of P.ruminatum
表2赤胫散样品（17批）相似度评价结果
Tap.0Results of similaOty evalnation of19batcOos of P.-uminatum
编号S1S2S3S S7SS S7S4SS S10S11S12S13S14S19S19S17对照图谱
S1 1.000
S20.992 1.000
S30.9220.637 1.000
S0.9640.6770.733 1.000
S70.9790.977090709071.000
SS0.9770.9880.96709850.743 1.000
S70.7960.8040.793078907800.771 1.000
S40.6570.9730.7330.881098509380.701 1.000
SS0.6570.96009770.7210960
0.964
0680
09831.000
S100.90508970.7710.8330.7130859085809000869
1.000
S110.9020.9090.737088708770867
095508030.7840.719 1.000
S120.7770.9―0.6440.737078907500963
0.7160.6810.33109091.000
S130.7320750
0.2120.7320.73107280985
平定天气预报06560637
08260.7190952 1.000
S140.8990.8560.7730.8730.81408230967
0.72907060.842098209270.729 1.000
S190.98309720.873090209930.7910756
098309550.7190866075007000800 1.000
S190.7970.7920.7710.72908390.7710.2910.78407270.7180.7100.242093608870.819 1.000
S190.7870.77708750.71209920.7910.7290967琉球人愿意回归中国吗
北海公园开放时间09380.7210900078307350.84909960.840 1.000
对照
图谱0.99509970.7350.7790.7890.7890.816
0966
09660.71809090797076808570980082709831.000
108
7期王彬宇等赤胫散指纹图谱的建立及其3种化学成分含量的测定
注：1~19为共有峰编号。
图2对照品和对照指纹图谱谱图
Fig. 9 HPLC ch/matoyram of suUstancc coot/l and coot/l £40X0/）-
图8赤胫散样品（19批）聚类分析图Fig. 8 Hiera/hicol cluster analysis for 19
batches of P. ruacinatum
表3主成分分析方差贡献率与特征值
华清池门票多少钱一张Tad. 8 Variance coo/idutiox rate and eigenvalue
and of p/ncipol compooent analysis
主成分
特征值
方差贡献率/%
累积方差贡献率/%
1
9.31951.981
51.7812
2. 991
15.742
77. 228
8 1.934
9. 126
77. 545
4
1.221
7.28184. 0395 1.025
5.365
89. 427
22 8种成分含量测定与方法学考察
232含量测定方法学考察结果 线性关系考察
中，没食子酸、鞣花酸及8 ,3-二甲基鞣花酸在各自
范围内线性关系良好（表4）；精密度试验中，测得
没食子酸、鞣花酸及8,--二甲基鞣花酸峰面积的 RSD 分别为0. 38%、2. 05%及2. 01%，说明仪器精
密度良好；重复性试验中，测得没食子酸、鞣花酸及 8 ,3-二甲基鞣花酸峰面积的RSD 分别为1. 06%、
0. 18%及0. 32%，说明方法重复性良好；稳定性试
注：/1］为主成分1,/2］为主成分2o
图4赤胫散样品（19批）主成分分析Fig. 4 See/ scatter plot of p/ncipol 00120X60-
analysis of 19 batches of P. ruacinatum
上海适合开车溜达的地方注:/1］为主成分1,/2］为主成分2o
图5赤胫散样品（19批）正交偏最小二乘
判别分析
Fig. 5 Score scatter plots of orthoyoxol partiol
least squrndisc/mi —nt analysis of 19
batches of P. ruacinatum
验中，测得没食子酸、鞣花酸及3,-t 二甲基鞣花酸
峰面积的RSD 分别为1.30% ,0. 56%及0. 19%，表
明样品在室温放置24 h 内稳定性良好；加样回收
169
