第一节 AAV病毒的生活周期
腺病毒伴随病毒（adeno-associated virus, AAV）是微小病毒科（Parvoviridae）家族的成员之一。这一家族成员是一类微小、无被膜及具有二十面体结构的病毒。病毒颗粒的直径在20～26nm之间，含有大小在4.7~6kb之间的线状单链DNA基因组。从昆虫到人类都已分离到微小病毒。AAV病毒属于依赖性病毒类（Dependovirus），最初是在纯化的腺病毒液中发现的一种污染成分（Atchinson et al. 1965）, 顾而得名。 从鸟类到许多哺乳动物包括人的体内都分离到各种血清型的AAV病毒。大多数成年人都感染过AAV病毒，但尚未发现该病毒是任何疾病的致病因素。在多数情况下，AAV在培养的正常细胞中不发生产毒性感染，只有在有辅助病毒包括腺病毒或疱疹病毒共同感染时才发生产毒性感染（Hoggan et al. 1966; Buller et al. 1981）。因此，AAV病毒长期以来被认为是一种缺陷性病毒。进一步的研究发现AAV病毒并非缺陷性病毒，而是在正常细胞中偏向于建立潜伏感染,仅在宿主细胞受到刺激时才被诱发进行感染性增殖。
AAV盘锦红海滩免费时间的生活周期有两种不同的胞内期。在无辅助病毒存在时，东莞附近的免费海滩AAV病毒颗粒进入细胞，脱衣壳后AAV的调节蛋白发生有限的表达，并抑制病毒基因的进一步表达和病毒DNA的复制。这种负调节作用的结果是促进病毒基因组整合到宿主的基因组中建立潜伏感染。 AAV病毒偏向于整合到人基因组19号染体q臂的特定位置（Kotin et al. 1990,1991,1992; Samulski et al. 1993）。研究被AAV病毒潜伏感染的细胞发现，AAV对细胞表型往往有微弱影响，并影响细胞对刺激的反应能力（Yalkinoglu et al. 1988; Yakobson et al. 1987,1989; Bantel-Schaal et al. 1992, 1991）。
AAV生活周期的另一种胞内期是产毒性感染，往往在有辅助病毒（腺病毒或疱疹病毒）感染时发生。辅助病毒的感染可以在AAV感染之前、同时或之后进行。腺病毒（Ad）和单纯疱疹病毒（HSV）中与辅助功能有关的基因都已确定。腺病毒中参与提供辅助功能的基因包括E1a, E1b, E2a, E4和VA RNA（Muzyczka 1992），但不包括与腺病毒DNA复制直接相关的E2b基因产物（DNA聚合酶和末端酶）。1型单纯疱疹病毒（HSV-1）提供辅助功能的情形则有些不同,不仅涉及与HSV病毒基因调节有关的基因包括ICP0和ICP4，还需要HSV病毒DNA复制的所必需的基因产物包括HSV螺旋酶－引物酶复合物（UL5，UL8，UL
52）和主要DNA结合蛋白UL29的参与（Weindler F et al. 1991）。这种在辅助功能方面的不同可能反映了腺病毒感染和疱疹病毒感染期间对宿主DNA合成机制的不同影响。
目前的关于AAV工作模式有以下要点：（1）AAV是一种生活周期以潜伏感染为主的病毒；（2）通过潜伏感染, 病毒基因组得以同细胞共存；（3）只要宿主细胞正常，AAV基因表达就处于抑制而维持潜伏状态；（4）如果细胞受到刺激，细胞内环境发生改变而表达应激基因；（5）导致细胞应激反应基因表达的调节状况也使得AAV基因表达，从而使AAV病毒复制；（6）产生子代病毒并释放，又感染新的正常宿主细胞，建立新的潜伏状态。
用某些可损伤基因的因素如紫外线照射、γ射线照射、各种化学致癌剂或某些代谢抑制剂处理某种类型的哺乳动物细胞，可使之在无辅助病毒存在的情况下能够发生AAV产毒性感染。虽然这种情形比有辅助病毒存在时每个细胞产生AAV病毒的量要低几个数量级，但上述实验提示AAV病毒并不是一种缺陷性病毒，而是一种强烈偏向于潜伏的病毒。
第二节 AAV病毒的基因组结构和功能
人2型腺病毒伴随病毒（AAV-2）的基因组为4681 个核苷酸的单链DNA，全部序列已测定。
正链和负链DNA均可被包装到AAV病毒颗粒中。AAV-2基因组的结构如图3-1所示。基因组的两末端为145bp的倒转末端重复序列（inverted terminal repeat, ITR）。ITR序列之间为AAV病毒的编码区，左侧的ORF编码4种Rep蛋白；右侧的ORF编码3种Cap蛋白。
一． ITR的结构和功能
AAV 病毒ITR的序列和结构见图3-2。每个ITR长145bp。 其中前125bp可形成一个T形的发夹结构，由两个小回纹结构（palindrome）（图2 B和C）组成，旁边为一个较大的回纹结构（A）。 ITR的序列可有两种构型：flip（B回纹接近3’端）或flop（C回纹接近3’端）。一个特定分子AAV的两个末端形成flip或flop的机率都相等。单链形式的AAV ITR容易形成如图2所示的T型发夹结构，还可能形成另外的构型。
ITR序列是AAV病毒的复制、整合、拯救和包装所必需的顺式作用元件。
二． Rep基因的结构和功能
Rep基因编码至少4种非结构蛋白：Rep78, Rep 68, Rep 52, Rep 40。由p5启动子起始的2种mRNA翻译成Rep78和Rep68； p19启动子起始的2种mRNA翻译成Rep52和Rep40（图内蒙古科技大学
3.1）。Rep52和Rep40蛋白C末端的氨基酸序列分别与Rep78和Rep68沂南县竹泉村旅游景点相同。 Rep 78和Rep68蛋白与AAV基因表达的正负调控有关。这两种蛋白都可以和ITR中的特定序列( 5’-GCTCGCTCGCTC-3’)结合。类似的序列在AAV的3个启动子上游均可到。当ITR自我折叠时可加强这种结合作用。Rep78/Rep68具有ATP酶和螺旋酶的功能。当其与ITR结合时便成为在124位点核苷酸处特异切割的缺口酶,识别的位点是5’-T/TGG。这两种蛋白对于AAV生活周期的每一时期都是必需的。在非允许条件下（没有辅助病毒和刺激因素），Rep蛋白只有微量表达，这种表达又能抑制其进一步的表达。另外，在非允许条件下Rep的表达似乎可抑制AAV基因组以直接方式复制。近来的研究证明Rep蛋白的表达对位点特异性整合是必需的。相反，在允许条件下，Rep蛋白的表达对AAV病毒从整合状态的拯救、各种AAV基因的表达和AAV DNA的复制都是必需的。
Rep52和Rep40参与了病毒的装配，它们在病毒双链DNA合成中是不需要的，但在单链DNA和病毒颗粒的累积中则是必需的。
三． Cap基因的结构和功能
Cap基因编码衣壳蛋白，其转录从p40启动子开始，形成约2.6kb和2.3kb mRNA,拼接后分
别编码三个结构蛋白VP1、VP2和VP3(图2) ，分子量分别为87、73和61kDa,在成熟毒粒中的比例为1:1:10。没有VP1时，VP2和VP3就可以包装子代单链DNA。但这样的毒粒感染性较低，提示VP1在病毒颗粒的稳定性或感染性上是需要的。VP2在病毒样空颗粒的装配中起重要作用。VP3 似乎需要与其它两个中的一个一起，完成核定位任务。
第三节 重组AAV的产生原理及常规制备、检测方法
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在基因研究中，重组逆转录病毒和重组腺病毒在基因转移载体中一直占主导地位。但近年来这一情况有所改变，用AAV作基因转移载体已成为基因研究的热点。这是由于AAV去北京是跟团好还是自由行具有以下特点：
（1） 安全性好。迄今从未发现野生型AAV对人体致病;重组AAV去除了野生型AAV基因组的96%，进一步保证了安全性；
（2） 宿主范围广。不仅可转导分裂细胞，而且可转导静止期细胞；
（3） 野生型AAV可整合到人基因组19号染体q臂的特定位置,利用这一特点,有可能研制出具有特异性整合功能的AAV载体;
（4） AAV-2的基因组仅4681个核苷酸, 便于用常规的重组DNA技术进行操作；
（5） 物理性质稳定。在60°C不能被灭活, 能抗氯仿;
（6） 重组AAV（rAAV）可长期稳定地表达外源基因。
一． 重组AAV的产生原理
目前在基因研究中所用的AAV载体均由2型AAV改造而来。AAV-2的ITR中包含了复制、包装、拯救及整合的信号，这使rAAV的产生成为可能：外源基因表达盒可完全取代AAV的编码序列，rep和cap基因产物则可由另一个质粒反式提供。参照野生型AAV的生活周期，表达外源基因的rAAV的产生需要4种成分参与：
